Analyse van het microbioom van de huid in ziekte en gezondheid

De mens is geevolueerd in een constante blootstelling aan microorganismen, en
ons genoom is ongetwijfeld gevormd door de selectiedruk die hiermee gepaard
gaat, zowel van commensale als externe (pathogene) organismen. Recente data
o.a. van ons eigen lab wijzen er op dat de fysische en chemische barriere die
gevormd wordt door onze huid, en ons beschermt tegen infecties, een rol speelt
bij gevoeligheid voor ziekten zoals psoriasis en eczeem (zie refs 1-3). Het is
zeer waarschijnlijk dat expositie aan microbiele agentia (denk aan bv TLR
liganden) en de respons daarop bijdraagt aan ontstaan of onderhouden van deze
ziekten. Door recente ontwikkelingen in de moleculaire biologie is het nu
mogelijk om een uitputtende analyse te maken van de total bacteriele flora van
een weefsel (het zogenaamde 'microbioom'). Recent zijn hierover artikelen
gepubliceerd die een begin hebben gemaakt met het microbioom van de huid (zie
refs 4-5). In de nabije toekomst zal de zgn deep-sequencing technologie hierin
cruciaal zijn. Deze maakt het mogelijk om een niet-gebiaste analyse te maken
van alle bacterien.


1. Palmer CN, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Zhao Y, Liao H, Lee SP, Goudie
DR, Sandilands A, Campbell LE, Smith FJ, O'Regan GM, Watson RM, Cecil JE, Bale
SJ,Compton JG, DiGiovanna JJ, Fleckman P, Lewis-Jones S, Arseculeratne G,
SergeantA, Munro CS, El Houate B, McElreavey K, Halkjaer LB, Bisgaard H,
Mukhopadhyay S, McLean WH Common loss-of-function variants of the epidermal
barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic
dermatitis. Nat Genet. 2006 38:441-6
2. Hollox EJ, Huffmeier U, Zeeuwen PL, Palla R, Lascorz J, Rodijk-Olthuis D,
van de Kerkhof PC, Traupe H, de Jongh G, den Heijer M, Reis A, Armour JA,
Schalkwijk J. Psoriasis is associated with increased beta-defensin genomic copy
number. Nat Genet. 2008 40:23-5
3. Rafael de Cid1*#, Eva Riveira-Munoz1*, Patrick L.J.M. Zeeuwen2*, Jason
Robarge3* (*shared first authorship), Wilson Liao4, Emma N. Dannhauser5,
Emiliano Giardina6, Philip E. Stuart7, Rajan Nair7, Cynthia Helms3, Georgia
Escaramís1, Ester Ballana1, Gemma Martín-Ezquerra8, Martin den Heijer9, Marijke
Kamsteeg2, Irma Joosten10, Evan E. Eichler11, Conxi Lázaro12, Ramón M. Pujol8,
Lluís Armengol1, Gonçalo Abecasis13, James T. Elder7, Giuseppe Novelli6, John
A.L. Armour5, Pui Kwok4, Anne Bowcock3, Joost Schalkwijk2, and Xavier
Estivill1,14 Deletion of the late cornified envelope (LCE) 3B and 3C genes as a
susceptibility factor for psoriasis. Nature Genet 2009, 41:211-5
4. Gao Z, Tseng CH, Strober BE, Pei Z, Blaser MJ (2008). Substantial
alterations of the cutaneous bacterial biota in psoriatic lesions. PLoS ONE 3:
e2719.
5. Grice EA, Kong HH, Conlan S, Deming CB, Davis J, Young AC, Bouffard GG,
Blakesley RW, Murray PR, Green ED, Turner ML, Segre JA (2009). Topographical
and temporal diversity of the human skin microbiome. Science 324: 1190-1192.

Het doel van ons onderzoek is om een microbioom analyse te maken van gezonde
huid, huid van patienten (plaque psoriasis, psoriasis inversa, atopisch
eczeem), huid van patienten tijdens regressie van lesies, en huid van gezonde
proefpersonen tijdens genezing van oppervlakkige beschadiging. Naast een
beschrijvende inventarisatie van de bacteriele flora, die grotendeels nieuw is,
zullen wij de samenstelling vergelijken van de verschillende groepen (ziek vs
gezond) en de dynamiek tijdens genezing. Wij hopen aanwijzingen te verkrijgen
over de betrokkenheid van microorganismen bij deze aandoeningen. Wij verwachten
niet op species niveau hier uitspraken over te kunnen doen maar wel op hogere
taxonomische aggregatienivo's (van genus tot phylum).

Methodologische aspecten

Het gaat hier om een pilot studie met betrekkelijk kleine groepen en grote
datasets (meer dan 10.000 sequenties per monster). Net als bij microarray
onderzoek brengt dit een grote family-wise error met zich mee wanneer men
significanties wil gaan vaststellen van verschillen tussen samples op species
nivo. Wij zullen ons bij de analyse dan ook richten op hogere taxonomische
aggregatieniveaus (genus tot phylum) en kijken naar verschillen/verschuivingen
in samenstelling tussen groepen, of verschuivingen van samenstellingen in
dynamische situaties (genezing).

Het onderzoek bestaat uit de volgende experimentele groepen:

Group 1. normale huid van gezonde controles (n=10)
Group 2. ge-tape-stripte huid van gezonde controles (n=10), zie hieronder
toelichting voor tape strippen
Group 3. lesionale en non-lesionale huid van onbehandelde atopisch eczeem
patienten (n=10)
Group 4. lesionale en non-lesionale huid van onbehandelde plaque psoriasis
patienten (n=10)
Group 5. lesionale en non-lesionale huid van onbehandelde psoriasis inversa
patienten (n=10)
Group 6. lesionale en non-lesionale huid, keel uitstrijkjes en ontlasting van
plaque psoriasis patienten tijdens therapie met anti-TNF (n=10); als controles
worden normale huid, keel uitstrijkjes en ontlasting van gezonde controles
meegenomen (n=10)
Group 7. voor de aanvang van de experimenten willen wij de procedure
optimaliseren (sample afname en DNA extractie). Hiervoor is een kleine groep
vrijwillligers nodig van gezonde controles (n=5) en psoriasis patienten (n=5)


Analyse van het huid microbioom

Groepen 1,3,4,5 and 7
Vrijwilligers worden geworven via onze database en via de polikliniek. Er zal
altijd een beperkte anamnese worden afgenomen om de diagnose te bevestigen. Wij
zullen eerst de methodes optimaliseren (samples uit groep 7). Zo zullen wij de
klassieke huiduitstrijkjes vergelijken met het afschrapen van stratum corneum.
De beste methode (DNA opbrengst, aantal gedetecteerde taxa) zal gekozen worden
voor de experimentele groepen 1-6. Aan alle vrijwilligers wordt verzocht om de
dag voorafgaand aan monsterafname niet te douchen (geldt voor alle groepen 1-7)
DNA uit de huidmonsters zal geextraheerd worden en geamplificeerd met
universele 16S RNA primers gevolgd door amplicon sequencing met de Roche 454
sequencing technologie. Bioinformatica analyse wordt verricht in samenwerking
met onze partners van het Nederlands Instituut voor Zuivel Onderzoek (NIZO) te
Ede. Op deze wijze hopen wij een uitputtende analyse te kunnen maken van de
bacteriele flora van de huid van patienten en gezonde controles. De
vrijwilligers die komen voor eenmalige sample afname ontvangen hiervoor een
vergoeding van 20 euro plus reiskosten vergoeding indien van toepassing.

Groep 2
In deze groep zullen wij normale huid niet-invasief beschadigen door het
herhaald aanbrengen en aftrekken van plakband (tape stripping). Hiermee wordt
het stratum corneum laag voor laag verwijderd (ca 20-30 keer strippen nodig) en
bereikt met het nagenoeg steriele compartiment (stratum granulosum). Deze
procedure verwijdert dus de huidbarriere en de huidflora. De epidermis herstelt
binnen ongeveer twee weken (macroscopisch en qua barrierefunctie). Wij zullen
de gestripte epidermis samplen op t=0, 1, 2, 4, 8 en 14 dagen. De normale huid
van de donor zal op t=0 en 14 dagen worden gesampled. Extractie van DNA en
sequencing geschiedt als hiervoor beschreven. De vrijwilligers ontvangen voor
deze hele reeks 180 euro plus reiskosten.

Groep 6
Deze groep bestaat uit psoriasis patienten die een reguliere behandeling zullen
ondergaan met een anti-TNF antilichaam (Enbrel). Wij zullen de patienten
verzoeken mee te doen aan dit onderzoek bestaande uit: verzamelen van
huidsamples, keeluitstrijkjes en ontlasting. Deze worden verkregen tijdens de
reguliere controles van de patienten en vormen derhalve een geringe extra
belasting. In totaal zullen de patienten 4 keer materiaal afstaan in een
periode van 3 maanden. De patienten ontvangen een vergoeding van 160 euro.
Parallel hieraan zullen huidsamples, ontlasting en keeluitstrijkjes van gezonde
vrijwilligers worden verzameld op twee tijdstippen met 3 maanden tussentijd (in
de zelfde periode als de monsterafname bij de patienten). Deze groep ontvangt
een vergoeding van 80 euro plus reiskosten.

Het risico voor de proefpersonen is zeer beperkt. Na tapestrippen kan
postinflammatoire hyperpigmentatie optreden. Deze is van voorbijgaande aard.
Alle handelingen aan de huid zullen zoveel mogelijk geschieden op plekken die
weinig cosmetische problemen geven (doorgaans bovenkant van de bil).