Onderzoek naar de ontwikkeling van de basofiele activatietest.

Er bestaan meerdere soorten testen om een allergie te diagnosticeren. Bij een
Type 4-reactie worden epicutane plakproeven gebruikt en de lymphocyte
transformation test (LTT). Bij Type 1-reacties gaat het meestal om eiwitten die
als allergeen fungeren. Hierbij zijn priktesten en het aantonen van IgE tegen
het allergeen de aangewezen tests. Er zijn echter ook patiënten die een directe
allergische reactie krijgen op kleinmoleculaire stoffen, wat wijst op
betrokkenheid van mestcellen en basofiele granulocyten, maar waarvan niet
(altijd) duidelijk is of er IgE bij betrokken is. Door activatie van de
basofiele granulocyten gaan deze degranuleren en worden er histamine en andere
mediatoren uitgescheiden. Hierdoor ontstaan de symptomen van een directe
(pseudo)allergische reactie. Het bepalen van het specifieke IgE is in dit geval
echter moeilijk, omdat de verdachte stof gebonden moet worden aan een drager.
Bij priktesten is er het risico dat patiënten een anafylactische reactie
ontwikkelen. Ook provocatietesten met bijvoorbeeld medicatie brengen dit risico
met zich mee. Uitbreiding van het diagnostische arsenaal is dus wenselijk.

De basofiele activatietest is een recent ontwikkelde diagnostische test,
waarbij in vitro het contact tussen allergeen en de mestcel en basofiele
granulocyt wordt nagebootst. Met behulp van flowcytometrie (FACS) is het
mogelijk om in bloed basofiele granulocyten te identificeren, ook als er een
klein aantal van aanwezig is. Met hulp van monoklonale antilichamen kunnen
activatiemarkers op de basofiele granulocyten geïdentificeerd worden en dit kan
activatie van de basofiele granulocyten aantonen.1 In meerdere studies is
aangetoond dat de basofiele activatietest een betrouwbaar instrument is om
degranulatiemarkers op de basofiele granulocyten aan te tonen bij verschillende
allergenen.2-7 Door het aantonen van activatie van basofiele granulocyten komen
er ook mogelijk aanvullende therapeutische opties voor deze patiëntengroepen
beschikbaar.

Doel van het project is om de basofiele activatietest te ontwikkelen en te
valideren als extra diagnostische mogelijkheid bij bepaalde patiëntengroepen
die met de huidige beschikbare test niet goed gediagnosticeerd kunnen worden of
waarbij er met het uitvoeren van tests risico is op anafylaxie.

Om de basofiele activatietest te kunnen valideren in ons laboratorium, wordt
eerst een allergeen gebruikt waarbij de basofiele activatietest goed is
gedocumenteerd. Hiervoor wordt 5 ml bloed van personen met
berkenpollen-allergie gebruikt. Dit bloed zal worden verkregen van patiënten
die bekend zijn met een allergie voor berkenpollen.
Vervolgens zal de basofiele activatietest worden ontwikkeld voor allergie voor
diclofenac. Hiervoor worden patiënten geïdentificeerd die in de afgelopen 3
jaar een allergische reactie hebben gehad op diclofenac en een orale
provocatietest hebben ondergaan. Andere proefpersonen zullen patiënten zijn die
een type-1 allergische reactie hebben gehad op bestanddelen uit cosmetische
middelen zoals benzophenon-3. Patiënten zullen mondeling worden benaderd om
deel te nemen aan het onderzoek en krijgen schriftelijke informatie voor
proefpersonen. Bij instemming om aan het onderzoek deel te nemen, ondertekenen
zij een informed consent. Voor alle testen worden personen als controle
gebruikt die de desbetreffende stof goed tolereren.
Afname van het bloed zal gebeuren door getrainde medewerkers van het
bloedafnamecentrum. Analyse van bloed zal binnen enkele uren na afname
plaatsvinden op het laboratorium Allergie & Longziekten van het LC.

Volbloed (100 µl) zal bij 37ºC worden geïncubeerd met 100 µl van het allergeen,
in verschillende concentraties, gedurende 15 minuten. Als controle zal het
volgende worden gebruikt: 100 µl volbloed met 100 µl anti IgE (0.1, 1 en 10 µg/
ml) als positieve controle en 100 µl volbloed met 100 µl activatie buffer als
negatieve controle. Reacties worden gestopt door koelen op ijs. Vervolgens
wordt het gekleurd door 20 µl monoklonaal PE-antihumaan IgE en 10 µl
monoklonaal, FITC-geconjugeerd antihumaan CD63 en APC-geconjugeerd antihumaan
CD203c gedurende 20 minuten toe te voegen. Daarna vindt er lysis van
erythrocyten en plaats en wordt het bloed gecentrifugeerd. Als marker voor
basofiele activatie wordt CD63 en CD203c gebruikt, zo nodig wordt IL-3 als
primer gebruikt om de sensitiviteit te vergroten voor CD63. 12
Tot slot vindt flowcytometrische analyse van de basofiele activatie plaats,
waarbij minstens 500 basofiele granulocyten nodig zijn voor analyse. Op basis
van side scatter en forward scatter kunnen basofielen geïsoleerd worden
De optimale concentratie van de allergenen zal worden gezocht om allergische
individuen zo goed mogelijk van niet-allergische individuen te scheiden.

Alle patiënten die op grond van hun allergietest in aanmerking komen voor
deelname aan het onderzoek worden mondeling geïnformeerd. In aansluiting daarop
ontvangt de patiënt schriftelijke informatie ondertekend door de
hoofdonderzoeker, waarin de opzet en het doel van het onderzoek nader worden
toegelicht.
Zowel schriftelijk als mondeling zal aan de patiënt nadrukkelijk worden verteld
dat op ieder moment deelname aan het onderzoek kan worden opgezegd, zonder dat
dit op enigerlei wijze van invloed zal zijn op de behandeling van de patiënt
door het UMCG.
Als een patiënt besluit tot participatie aan het onderzoek, zal om
schriftelijke toestemming worden gevraagd door ondertekening van het
toestemmingsformulier door de patiënt en de onderzoeker. De belasting voor
patiënten zal tot een minimum worden beperkt en zal bestaan uit afname van één
buisje (5ml) bloed. De bloedafname wordt verricht door ervaren gekwalificeerde
medewerkers van het bloedafnamecenrum van het UMCG. De tijdsinvestering door de
patiënt/deelnemer bedraagt circa 5 a 10 minuten, en betreft uitsluitend de
bloedafname. Het invullen van vragenlijsten of andere gegevensdragers is niet
nodig.
Voor de gezonde vrijwilligers zal dezelfde procedure worden gevolgd.