Bestudering van (toegenomen) expressie van pyruvaatkinase antigeen and dyserythropoiese in patienten met pyruvaatkinasedeficientie

De volwassen rode bloedcel is voor zijn energievoorziening volledig afhankelijk
van de glycolyse. Pyruvaatkinase (PK) is een belangrijk enzym in deze metabole
route en een deficiëntie van dit eiwit is de meest voorkomende stoornis van de
glycolyse. Het is daarmee een belangrijke oorzaak van hereditaire
non-sferocytaire hemolytische anemie (van Wijk en van Solinge 2005). Klinische
symptomen ten gevolge van PK deficiëntie komen in het algemeen alleen voor bij
patiënten die compound heterozygoot of homozygoot zijn voor een mutatie in het
PKLR gen. Het klinisch beeld is erg variabel (Zanella et al, 2007); patiënten
met identieke genotypen kunnen een heel verschillend klinisch beeld hebben (van
Wijk en van Solinge, 2006). Er is tevens geen relatie tussen de rest
enzymactiviteit en de ernst van de hemolyse. Met andere woorden: bij
PK-deficiëntie bestaat er een slechte correlatie tussen genotype en fenotype.
Metabool gezien leidt een deficiëntie van PK tot een verlaagde enzymactiviteit.
Als gevolg daarvan ontstaat er een tekort aan adenosinetrifosfaat en een
verhoging van de hoeveelheid 2,3-bisfosfoglyceraat. Uiteindelijk resulteert dit
in een verkorte overlevingsduur van de rode bloedcel (Valentine en Paglia,
1980). De precieze mechanismen hierbij betrokken zijn echter niet bekend.

Bij PK-deficiënte patiënten is het aantal hematopoëtische voorlopercellen,
waaronder CFU-GM, BFU-E, en CFU-GEMM, in de milt veel hoger dan in gezonde
mensen (Aizawa et al, 2003). Dit duidt erop dat er bij PK-deficiënte patiënten
verhoogde extramedullaire haematopoiese plaatsvind. Daarnaast bevat de milt van
PK-deficiënte patiënten veel apoptotische cellen terwijl dergelijke cellen niet
teruggevonden worden in de milt van gezonde proefpersonen (Aizawa et al, 2003).
Deze bevindingen suggereren dat PK-activiteit noodzakelijk is voor een goede
uitrijping van erythroide voorlopercellen, door het voorkomen van apoptose. Bij
muizen is aangetoond dat PK-deficiëntie in rode bloedcellen geassocieerd is met
ineffectieve erythropoëse (Aizawa et al, 2005). Daarnaast is in een PK
deficiënte muizen cellijn aangetoond dat overexpressie van recombinant
wild-type PK in staat is om de expressie van pro-apoptotische genen zoals Bad,
Bnip3 en Bnip3I te verminderen (Aisaki et al, 2007).

Onze onderzoeksgroep heeft recent aangetoond dat verlies aan PK enzymactiviteit
niet altijd gepaard gaat met een kwantitatieve reductie van de hoeveelheid PK
antigeen. In ongeveer de helft van de patiënten is het juist geassocieerd met
een (sterke) stijging van de hoeveelheid PK antigeen (van Wijk et al, 2009).
Omdat bij vele patiënten de onderliggende mutatie juist instabiliteit van het
eiwit voorspelt, is deze toename van de hoeveelheid eiwit een intrigerende
observatie. De resultaten suggereren dat de metabole verstoring ten gevolge van
PK-deficiëntie leidt tot een verhoogde expressie van het PKLR gen gedurende
erythroide differentiatie en uitrijping. Deze bevindingen hebben geleid tot de
hypothese dat de verhoogde expressie van PK dient ter compensatie van het
verlies aan enzymactiviteit. Het is daarnaast mogelijk dat deze overexpressie
de PK-deficiënte erythroïde voorlopercel beschermt tegen apoptose door de
expressie van pro-apoptotische genen te remmen. De hoeveelheid PK antigeen is
daarom mogelijk een belangrijke determinant van het klinische fenotype en,
daarmee samenhangend, belangrijk om tot een beter begrip van de complexe
fenotype-genotype correlatie van deze ziekte te komen.

Aisaki, K., Aizawa, S., Fujii, H., Kanno, J. & Kanno, H. (2007) Glycolytic
inhibition by mutation of pyruvate kinase gene increases oxidative stress and
causes apoptosis of a pyruvate kinase deficient cell line. Exp Hematol, 35,
1190-1200.
Aizawa, S., Harada, T., Kanbe, E., Tsuboi, I., Aisaki, K., Fujii, H. & Kanno,
H. (2005) Ineffective erythropoiesis in mutant mice with deficient pyruvate
kinase activity. Exp Hematol, 33, 1292-1298.
Aizawa, S., Kohdera, U., Hiramoto, M., Kawakami, Y., Aisaki, K.-I., Kobayashi,
Y., Miwa, M., Fujii, H. & Kanno, H. (2003) Ineffective erythropoiesis in the
spleen of a patient with pyruvate kinase deficiency. Am J Hematol, 74, 68-72.
Valentine, W.N. & Paglia, D.E. (1980) The primary cause of hemolysis in
enzymopathies of anaerobic glycolysis: a viewpoint. Blood Cells, 6, 819-829.
Van Wijk, R., Huizinga, E.G., Van Wesel, A.C.W., Van Oirschot, B.A., Hadders,
M.A. & van Solinge, W.W. (2009) Fifteen novel mutations in PKLR associated with
pyruvate kinase (PK) deficiency: structural implications of amino acid
substitutions in PK. Hum Mutat, 30, 446-453.
van Wijk, R. & van Solinge, W.W. (2005) The energy-less red blood cell is lost:
erythrocyte enzyme abnormalities of glycolysis. Blood, 106, 4034-4042.
van Wijk, R. & van Solinge, W.W. (2006) Pyruvate kinase deficiency: genotype to
phenotype. Hematology (EHA Educ Program), 2, 55-62.
Zanella, A., Fermo, E., Bianchi, P., Chiarelli, L.R. & Valentini, G. (2007)
Pyruvate kinase deficiency: the genotype-phenotype association. Blood Rev, 21,
217-231.

Primaire doel: De hier beschreven studie heeft tot doel om de recentelijk
verkregen resultaten omtrent verhoogde expressie van PK antigeen in
PK-deficiënte patiënten te versterken. Dit kan behaald worden door het aantal
patiënten en gezonde proefpersonen te vergroten. De hoeveelheid PK antigeen zal
o.a. worden gecorreleerd met het klinische fenotype en het genotype.

Secundaire doel(en):
Deze studie heeft als secundair doel te onderzoeken of humane PK-deficiënte
hematopoietische stamcellen kunnen differentiëren en uitrijpen naar erythroïde
cellen. De pro-apoptotische gen-expressie in PK deficiënte erythroïde cellen
zal daarbij nader worden onderzocht.

Dit onderzoek wordt uitgevoerd als een observationele case-control studie.
Bloedmateriaal van 25 PK-deficiënte patiënten en 25 gezonde normale
proefpersonen zal worden verzameld en gebruikt om het volgende te bepalen:
1. de hoeveelheid PK-antigeen in volwassen rode bloedcellen;
2. de in-vitro capaciteit van haematopoietische stamcellen om BFU-E*s en
CFU-E*s te genereren.
3. de expressie van pro-apoptotische genen (e.g. BAD, BNIP3, BNIP3I) in
erythroïde voorlopercellen.

Bij patiënten en gezonde proefpersonen zal eenmalig 35 ml veneus bloed worden
afgenomen met behulp van een venapunctie. Bij patiënten <12 jaar zal deze
hoeveelheid 20 ml bedragen. Om het ongemak zoveel mogelijk te beperken zal de
afname worden gecombineerd met reguliere controlebezoeken aan de behandelend
arts.