Onze studie is onderdeel van de multicentre studie "e-OPMD": bijeenbrengen van OPMD onderzoek in Europa.
"Pathofysiologie en therapeutische benaderingen van oculofaryngeale spierdystrofie (OPMD)"

Oculopharyngeaal musculair dystrofie (OPMD) is een autosomaal dominante,
late-onset (>40 jaar) spierdystrofie welke klinisch wordt gekarakteriseerd door
langzaam progressieve ptosis, dysphagie, en limb-girdle spierzwakte. OPMD is
zeldzaam (1:100000 in europa) met een wereldwijde distributie. In bepaalde
ethnische groepen heeft het een hogere incidentie zoals de Frans Canadezen in
Quebec en de Bukhara Joden in Israel.
OPMD wordt veroorzaakt door een GCG-repeat expansie in het gen dat codeert voor
het eiwit poly(A)binding protein nuclear 1 (PABPN1). Deze GCG repeat codeert
voor een alanine verlenging aan de N-terminus van de proteïne. The gemuteerde
vorm van PABPN1 bevat daardoor 12-17 alanines, terwijl de normale vorm van
PABPN1 10 alanines bevat.
Histologisch wordt OPMD gekenmerkt door intranucleaire filamenten in
spiercellen (INI's).
Echter de pathofysiologische mechanismen, hoe dit gendefect moleculair leidt
tot deze intranucleaire filamenten en spierdysfunctie en waarom alleen
specifieke spieren zijn aangedaan, is nog onbekend. Net als bij andere
proteinopathieen of "eiwit-aggregatieziekten" zoals M. Huntington is er geen
farmacologische behandeling bekend.
Bekend is dat deze INI*s bestaan uit zowel onoplosbare PABPN1 moleculen (Calado
et al. 2000) als ubiquitine (= een regulatorproteïne die aan kapotte eiwitten
bindt om ze te taggen voor degradatie via de ubiquitine-proteasome degradatie
pathway), maar ook subunits van het proteasoom (= groot eiwitcomplex dat
eiwitten degradeert). Het idee is nu dat deze GCG expansie een *gain-
of-function* mutatie is en dus zorgt voor het verkeerd opvouwen en aggregatie
van het eiwit, waardoor het in spiercellen wordt getarget voor de
ubiquitine-proteasome degradatie pathway (Calado et al. 2000). Maar de volgens
de nieuwste inzichten, gepubliceerd binnen dit project, lijkt het
ubiquitine-proteasome-systeem (UPS) zelf ook het meest waarschijnlijk de
gedereguleerde pathway te zijn bij OPMD (Anvar et al 2011). Anvar vond in 2011
dat de expressie van expPABPN1 (de gemuteerde vorm) leidt tot down-regulatie
van de genen die coderen voor het proteasoom. Andersom leidt downregulatie van
het proteasoom, gedurende het ouder worden, tot expPABPN1 accumulatie. Welke
dan weer leidt tot uitgebreidere proteasome downregulatie. Dit feedforward
model zou kunnen bijdragen aan de INI's in specifieke spiergroepen en de
late-onset van OPMD (Anvar 2011).
Verder laat recent onderzoek zien dat de ratio oplosbaar (normaal PABPN1)/
onoplosbaar expPABPN1 moleculen in OPMD lager is dan in normale spiercellen
(Raz et al Am J Pathol. 2011 Aug 17). Hier wordt juist verondersteld dat het
feit dat er minder oplosbaar PABPN1 aanwezig is, kan bijdragen aan de typische
spierzwakte (Raz 2011).
De normale functie van PABPN1 is *nucleaire polyadenylatie*(= een mRNA reactie
welke leidt tot de formatie van een poly(A)staart aan het 3*einde van mRNA*s
(Wahle 1991)). In muis en drosophila modellen is gevonden dat een lagere
hoevellheid PABPN1, in vivo zorgt voor een verkorte poly(A)staart in mRNA
(benoit et al 2005, Apponi et al. 2010). Onder andere hierdoor, wordt
verondersteld dat ook mRNA metabolisme betrokken is bij OPMD pathogenese.
Recente data hebben ook verondersteld dat apoptose een rol speelt bij OPMD
pathogenese (Chartier et al. 2006, Davies et al. 2008).
Het doel van dit Europese samenwerkingsverband is nu het achterhalen van de
moleculaire en cellulaire mechanismen ten grondslag aan OPMD pathogenese en met
behulp daarvan innovatieve therapeutische strategieën te ontwikkelen. De kracht
van dit samenwerkingsverband is dat er zowel verschillende diermodellen (muis
en Drosophila) voorhanden zijn, met elk hun specifieke voordeel, als materiaal
van OPMD patiënten, tezamen met expertise op genetisch en moleculair gebied.
Binnen het consortium zijn genetisch bekende Drosophila modellen met
poly-alanine-extensies van verschillende lengte voorhanden. Studies hiermee
hebben laten zien dat niet alleen de polyalanine verlenging een voorwaarde is
voor de ziekte, maar dat de context van het eiwit ook belangrijk is. Er is ook
een muismodel aanwezig met expressie van alanine-verlengde-PABPN1 in
skeletspieren. Fenotype studies in combinatie met transcriptoom analyse in dit
model hebben laten zien dat er sprake is van spieratrofie, beperkt tot de
snelle glycolytische vezels (Trollet et al 2010). Verder zijn er biopsieen van
patiënten aanwezig binnen dit consortium. Ook zullen er nieuwe biopten genomen
moeten worden. Hierdoor zijn er humane spiercellen van zowel aangedane als niet
aangedane spieren in verschillende ziektestadia aanwezig.
Al eerder zijn door deelnemers aan dit consortium therapeutische strategieën
ontwikkeld in Drosophila species, in de vorm van intrabodies (=antilichamen die
zich intracellulair targetten tegen een specifiek proteïne) tegen PABPN1
(Verheesen et al. 2006), welke de symptomen van OPMD volledig kunnen
voorkomen(Chartier et al 2009).

Significant begrip van de pathofysiologische mechanismen van OPMD en
consequente evidence based therapeutische benaderingen, worden ernstig
belemmerd in een zeldzame aandoening, zoals OPMD, vanwege het moeilijk kunnen
genereren van voldoende grote patiënten datasets en gelimiteerde
beschikbaarheid van relevante biomodellen. Het eOPMD netwerk combineert
klinisch onderzoek met fundamenteel onderzoek en analyseert deze op grote
schaal (histologisch, genetisch, moleculair, cellulair) om de pathofysiologie
van deze zeldzame aandoening te begrijpen en hierop nieuwe therapeutische
strategieën te ontwikkelen.

Het onderzoeksteams betroken bij dit netwerk, bestaat uit 5 hoofdpartners met
elk hun unieke expertise:
Partner 1: Dr. Martine Simonelig . Institut de genetique Humaine UPR 1142 CNRS.
France.
Partner 2: Dr. Vered Raz. Leiden University medical Centre- Human genetics.
Partner 3: Dr. Gillian Butler-Browne. Institut de myologie UMRS 974. France.
Partner 4: Prof. George Dickson. Royal Holloway- University of London. UK.
Partner 5. Prof. Dr. Baziel van Engelen. Radboud university Nijmegen Medical
centre. Dept. Neurology.

Ons aandeel binnen deze studie zal zijn:
- Het herhalen van spierbiopsieen bij de symptomatische OPMD patiënten die in
2003 reeds in ons centrum zijn gebiopteerd in het kader van de toenmalige
genotype-fenotype studie (Protocolnummer: d.d. 12-06-2002, CMO-nr: 2002/108).
- Tevens zullen er spierbiopten genomen worden bij nieuwe OPMD patiënten,
bekend in ons centrum.
- Ook zullen we bij de volwassen nakomelingen van deze nieuw gediagnosticeerde
OPMD patiënten spierbiopten afnemen.

Er zullen bij alle bovenstaande proefpersonen biopten genomen worden van een
klinisch vaker aangedane spier (quadriceps) en een klinisch niet vaak aangedane
spier (tibialis anterior). Hiermee willen wij de volgende onderzoeksvragen
beantwoorden:
- Welke pathways zijn gedereguleerd bij ziekteprogressie? Door middel van
vergelijkende transcriptoom analyse van de oude (2003) en nieuwe (2011)
quadriceps biopten van de patiëntenpopulatie die in 2003 ook al gebiopteerd
was, willen we de pathways achterhalen, die betrokken zijn bij de
ziekteprogressie te kunnen onderzoeken met zo min mogelijk inter-individuele
variatie.
- Waarom manifesteert deze genetische aandoening, waarbij een gen betrokken is
met vele functies in het hele lichaam, zich alleen in bepaalde spiergroepen?
Door middel van vergelijkende transcriptoom analyse van de klinisch vaker
aangedane spier (quadriceps) met de klinisch niet-aangedane spier (tibialis
anterior) van alle symptomatische en presymptomatische OPMD patiënten, willen
we de moleculaire basis te achterhalen waarom deze genetische aandoening zich
alleen in enkele spiergroepen manifesteert, wederom met zo min mogelijk
inter-individuele variatie.
- Welke pathways zijn betrokken bij het ontstaan van de ziekte? Door middel van
vergelijkende transcriptoom analyse op de biopten van de volwassen nakomelingen
van nieuwe OPMD patiënten (die volgens DNA analyse drager blijken te zijn van
de mutatie) met de biopten van OPMD patiënten, maar ook door de quadriceps en
tibialis anterior in dezelfde presymptomatische patiënt te vergelijken, willen
we gedereguleerde pathways achterhalen betrokken bij ontstaan van de ziekte en
verschillende ziektestadia. Zie flowchart 2 p.22 van het protocol.

Ook zullen wij bij alle symptomatische OPMD patiënten vragenlijsten (zie sectie
E1/E2) afnemen omtrent begin en beloop, huidige klachten en impact van de
ziekte. We willen bij alle proefpersonen (dus OPMD patient en hun volwassen
nakomelingen) een neurologisch onderzoek verrichten, waaronder een
spierkrachtmeting met een handhelddynamometer en bij alle proefpersonen een
venapunctie doen voor DNA diagnostiek en enkele bloedwaarden (CK, ALAT, ASAT,
LDH).
Zo hopen wij klinische gegevens te correleren met histologische en genetische
kenmerken binnen de Nederlandse OPMD populatie die nog nooit in zo grote getale
in beeld is gebracht. Onze studie is dus tweeledig: Enerzijds dragen we binnen
deze multicentre studie bij aan opheldering omtrent de pathofysiologie van
OPMD, anderzijds brengen de Nederlandse OPMD populatie in beeld.
Deze resultaten zullen binnen het e-OPMD project, samen met de resultaten van
de diermodellen, gebruikt worden om toekomstige clinical trials met gen- en
farmacologische therapieën voor OPMD op te baseren.

Binnen dit hele Europese samenwerkingsproject zullen we met behulp van
dierlijke modellen en materiaal van patiënten de pathofysiologische mechanismen
van OPMD achterhalen om therapeutische mogelijkheden daarop te kunnen baseren.
Vanwege het gebruik van zowel verschillende diermodellen (met elk hun voordeel)
als patiëntmateriaal en een variëteit aan genetische en moleculaire technieken
en vaardigheden binnen het netwerk die elkaar aanvullen, zijn we in staat om:
A. moleculaire en cellulaire pathways te ontdekken die ten grondslag liggen aan
de OPMD.
B. de informatie verkregen uit het diermodellen valideren op patiëntmateriaal.
C. de farmacologische benaderingen van OPMD testen en de therapie met het
hoogste therapeutische potentieel identificeren.
Doordat we trans-model-transcriptoom analyse kunnen combineren met snelle en
efficiënte genetische en supressor screeningen in drosophila en functionele
studies in muizen kunnen valideren in menselijke cellen en weefsels, zijn we in
staat om de pathogenese van OPMD te achterhalen, om hierop een rationele
evidence based therapeutische strategie te ontwikkelen.

De doelen van het volledige onderzoek zijn verdeeld over de 5 partners:
Doel 1: (door partner 1 en3 ) Identificatie van de moleculaire pathways die
betrokken zijn bij OPMD met behulp van genetische screens op een drosophila
model.
Doel 2: (verantwoordelijke partner 2, mbv partner 1-5)
a).De onderliggende pathofysiologische mechanismen van OPMD identificeren door
trans-model transcriptoom vergelijking.
b). Valideren van de gedereguleerde pathways op muis-modellen en
patientbiopsieen.
c). Functionele validatie van de biologische pathways van OPMD door het gebruik
van Drosophila model.
d). Identificatie van spierspecifieke gedereguleerde pathways door
transcriptoom en proteoom analyse van spierbiopten.
e.) (partner 5) het correleren van histologische en klinische kenmerken van NL
OPMD patienten.
Doel 3: (verantwoordelijke partner 3, mbv partner 3-4) Ontwikkeling van
gen-therapie strategieën voor OPMD.
Doel 4: (verantwoordelijke partner 4, mbv partner 1 en 4) Farmacologische
benadering voor behandeling van OPMD.

De doelen specifiek voor ons centrum zullen zijn:
A. Bijdragen aan dit multicentre onderzoek door middel van het afnemen van 2
spierbiopten bij NL OPMD patienten en hun volwassen nakomelingen.
met als deeldoelen:
I.) Het identificeren van spiergroepspecifieke gedereguleerde pathways die
betrokken zijn bij de progressie van OPMD door het herhalen van spierbiopsieen
bij patiënten die reeds gebiopteerd zijn in 2003. Op zowel de oude als de
nieuwe biopsieen (quadriceps) zullen dan transcriptoom analyses gedaan worden
om de pathways die betrokken zijn bij de progressiviteit van OPMD te
achterhalen, met zo min mogelijk inter-individuele variatie.
II.) Het achterhalen van de pathway die betrokken zijn bij de specifieke uiting
van OPMD op alleen bepaalde spiergroepen (oogsluit- slik- en limbgirdle-
spieren) door middel vergelijkende transcriptoom analyse van zowel niet
aangedane (tibialis antierior) als een klinisch vaker aangedane (quadriceps)
spieren van OPMD patiënten.
III.) Het achterhalen van pathways die betrokken zijn bij onstaatn van de
ziekte door middel van vergelijkende transcriptoom analyse van de quadriceps
biopten van presymptomatische OPMD patienten met de symptomatische OPMD
patienten.

B. Het klinisch, histologisch en genetisch in kaart brengen van de Nederlandse
OPMD populatie.

- Wij hebben een database met daarin alle OPMD patienten die bekend zijn in
onze kliniek vanaf 2003.Wij zullen al deze patienten informatie over deze
studie toesturen en vragen of zij mee willen doen.
- Van al deze patienten in de database is bekend of zij al eerder in de studie
voorgaand aan deze studie, hebben geparticipeerd (Protocolnummer: d.d.
12-06-2002, CMO-nr: 2002/108). Van de OPMD patienten die niet hebben meegedaan
aan de voorgaande studie, zullen ook de volwassen nakomelingen worden benaderd.
Aan hen wordt ook informatie verstrekt en gevraagd of zij willen participeren
aan deze studie.
- zodra we informed consent hebben, zullen we specifieke vragenlijsten sturen
aan de OPMD patienten en voor alle proefpersonen (zowel OPMD patienten als hun
volwassen nakomelingen) de onderzoeksdag plannen.
- Op de onderzoeksdag zal er bij alle proefpersonen een korte anamnese worden
afgenomen,
- een neurologisch onderzoek gedaan worden, inclusief een spierkrachtmeting met
de handheld dynamometer.
- een venapunctie gedaan worden voor DNA diagnostiek (als dit nog niet al
gedaan is) en bloedwaarden die duiden op spierschade (CK, ALAT, ASAT en LDH).
- een naaldbiopt worden afgenomen van 2 spieren (m. quadriceps en m. tibialis
anterior).

- De transcriptoom analyse op de biopten zal worden uitgevoerd door partner 2 ,
LUMC.
- Er zal histologische analyse gedaan worden op de biopten in ons centrum.
- correleren van histologische, genetische en klinische gegevens van de
patiënten.

Voor het onderzoek moeten de deelnemende personen eenmaal naar het UMC St.
Radboud te Nijmegen reizen, de onderzoeken worden gepland op 1 dagdeel. De
belasting voor de deelnemende persoon is met name de tijd die hij/zij ervoor
moet vrijmaken. De bloedafname en spierbiopt vormen geen additionele risico's.