Blood outgrowth endothelial cell - gemedieerde bloedstolling

Samenvatting

Het risico op het ontwikkelen van een bloeding of trombose is met de huidige
kennis van het bloedstollingsysteem nog steeds moeilijk te meten. Het doel van
dit fundamentele onderzoek is om beter inzicht te verkrijgen in de
bloedstolling door middel van een gedetailleerde karakterisering van
voorlopercellen van het endotheel, de zogenaamde *blood outgrowth endothelial
cells* (BOECs), die in kleine hoeveelheden circuleren in het bloed [1]. Meer
informatie over de specifieke rol van endotheel-gemedieerde mechanismen in het
stollingsysteem zal bijdragen aan de identificatie van nieuwe parameters voor
een betere en meer nauwkeurige beoordeling van het individuele risico op een
bloedings- of stollingsneiging.

Het endotheeloppervlak speelt een belangrijke rol in de bloedstolling. Echter,
in de gebruikelijke stollingstesten wordt de functie van het endotheel buiten
beschouwing gelaten omdat deze niet direct in het bloed meetbaar is. In het
Einthoven Laboratorium voor Experimentele Vasculaire Geneeskunde beschikken we
over de expertise om BOECs volgens bestaande procedures te isoleren en op te
kweken tot volledig functionele endotheelcellen [2]. In dit onderzoek zullen
deze BOECs geïsoleerd worden uit het bloed van gezonde vrijwilligers. In de
vervolgens gegenereerde endotheelcellijnen zal de biosynthese en expressie van
verschillende endotheeleiwitten die een belangrijke rol spelen in het
bloedstollingsmechanisme gekarakteriseerd en gekwantificeerd worden. De
uitkomsten van dit onderzoek zullen worden opgenomen in een rekenkundig model
van het stollingssysteem, met als overkoepelend doel om aan de hand van dit
verbeterde model parameters te identificeren die het risico op het ontwikkelen
van een bloedings- of stollingscomplicatie meten.


Achtergrond

Huidige risico*s bloedingen/trombose moeilijk in te schatten
Het bloedstollingsysteem bestaat uit een ingewikkelde set van reacties die het
lichaam beschermen tegen bloeding en trombose. Een voorbeeld van de
laatstgenoemde afwijking is veneuze trombose, welke de meest optredende
complicatie bij ziekenhuisopname is en voorkomen kan worden mits het juiste
protocol wordt opgevolgd [3]. Helaas is er tot op heden geen goede
stollingstest voorhanden die vooraf kan bepalen welke patiënten een verhoogd
risico hebben op het ontwikkelen van trombose. Veneuze trombose wordt behandeld
door medicatie met zogenaamde bloedverdunners, waarvan de effectiviteit
getoetst wordt aan de hand van de *International Normalized Ratio* (INR).
Ofschoon met deze methode bloedingen door overdosering normaliter voorkómen
worden [4], kunnen medicatie gerelateerde bloedingen toch ontstaan, zelfs als
de metingen binnen de streefwaarden van de INR blijven. Zo heeft een studie
aangetoond dat per jaar 3% van de patiënten die met een oraal
antistollingsmiddel door de trombosedienst in Nederland worden behandeld een
ernstige (orgaan)bloeding krijgen [5]. Deze voorbeelden geven aan dat er een
duidelijke vraag is naar nieuwe testen die het bloedings- en tromboserisico in
elk individu beter kunnen bepalen. Een verbeterd rekenkundig model van de
bloedstolling kan hierbij als leidraad dienen en een indicatie geven welke
parameters hiervoor getest moet worden.

Rol van endotheelcellen in bloedstolling
Aangezien endotheelcellen de vaatwand bekleden en veel membraan gebonden
eiwitten bevatten, is de bijdrage van deze cellen aan de bloedstolling niet
direct meetbaar in afgenomen bloed en/of plasma. Deze cellen en hun
bestanddelen spelen echter wel een belangrijke rol in het stolproces en hun
acties moeten dan ook in beschouwing genomen worden om goede voorspellingen te
kunnen doen over de bloedstolling. Endotheelcellen zijn via verschillende
mechanismen betrokken bij de bloedstolling, zoals via de aanmaak van von
Willebrand factor (VWF). Wanneer het endotheel geactiveerd wordt komt VWF vrij
in de bloedbaan, waar het bijdraagt aan de adhesie en aggregatie van
bloedplaatjes. Voorts fungeert VWF ook als dragereiwit van bloedstollingsfactor
VIII; beide functies zijn belangrijk voor het procoagulante effect van VWF [6].
Een andere groep endotheel-specifieke stollingseiwitten maakt onderdeel uit van
het proteïne C systeem [7]. Dit systeem raakt geactiveerd wanneer trombine
bindt aan trombomoduline (TM), een membraaneiwit dat zich op endotheelcellen
bevindt. Het zo gevormde complex zet proteïne C om in geactiveerd proteïne C
(APC), welke samen met zijn cofactor proteïne S in staat is de
bloedstollingsfactoren Va en VIIIa te inactiveren, waarop de bloedstolling
wordt geremd. APC kan ook binden aan de endotheliale proteine C receptor
(EPCR), een ander membraaneiwit dat verankerd is op het endotheel. Dit complex
is in staat protease activated receptor 1 (PAR-1), een endotheel
transmembraaneiwit, te activeren waardoor er een beschermend (*cytoprotective*)
effect op het endotheel ontstaat [8]. Recentelijk is er ontdekt dat het enzym
proteïne disulfide isomerase (PDI) vrijkomt wanneer het endotheel een
protrombotisch fenotype aanneemt. PDI zet encrypted tissue factor om in
geactiveerd tissue factor en draagt op deze manier bij aan de bloedstolling [9].

Bovenstaande opsomming geeft aan dat het endotheel via diverse mechanismen een
belangrijke rol speelt in de stollingscascade; helaas ontbreekt tot op heden
een gedetailleerde karakterisering van hun directe contributie aan de
bloedstolling. Dit onderzoek heeft daarom als doelstelling deze
endotheel-gemedieerde mechanismen en hun relatie tot het stollingssysteem beter
te karakteriseren door de biosynthese en expressie van verschillende eiwitten
te karakteriseren en kwantificeren in BOECs. Dit zal gedaan worden onder zowel
normale omstandigheden als onder condities die in vivo aanleiding kunnen geven
tot trombose (zoals bij weinig zuurstof, met weinig voedingsstoffen, bij lage
pH en in aanwezigheid van ontstekingsmediatoren). De opgedane kennis zal uniek
inzicht verschaffen in de bijdrage van endotheelcel-specifieke
stollingscomponenten aan de normale stolling evenals aan trombose.

Rekenkundig model
Alle informatie die verkregen wordt in dit onderzoek zal worden ingevoerd in
een nieuw rekenkundig model van de bloedstolling. Door ook de bijdrage van de
endotheelcel-gemedieerde mechanismen hierin op te nemen zullen de
voorspellingen van dit model meer overeenkomen met de werkelijkheid. Dit
simulatie model van de bloedstolling zal de basis leggen voor de ontwikkeling
van een optimale combinatie van stollingstesten om de hemostatische balans van
een individuele patiënt in kaart te brengen en daarmee te bepalen in hoeverre
deze patiënt een risico voor het ontwikkelen van een bloeding of trombose bezit.


Referenties (1)
1. Lin Y, Chang L, Solovey A, Healey JF, Lollar P, Hebbel RP. Use of blood
outgrowth endothelial cells for gene therapy for hemophilia A. Blood. 2002 Jan
15;99(2):457-62
2. van den Biggelaar M, Bouwens EA, Kootstra NA, Hebbel RP, Voorberg J, Mertens
K. Storage and regulated secretion of factor VIII in blood outgrowth
endothelial cells. Haematologica. 2009 May;94(5):670-8
3. Cohen AT, Tapson VF, Bergmann JF, Goldhaber SZ, Kakkar AK, Deslandes B,
Huang W, Zayaruzny M, Emery L, Anderson FA Jr; ENDORSE Investigators. Venous
thromboembolism risk and prophylaxis in the acute hospital care setting
(ENDORSE study): a multinational cross-sectional study. Lancet. 2008 Feb
2;371(9610):387-94
4. Cannegieter SC, Rosendaal FR, Wintzen AR, van der Meer FJ, Vandenbroucke JP,
Briët E. Optimal oral anticoagulant therapy in patients with mechanical heart
valves. N Engl J Med. 1995 Jul 6;333(1):11-7
5. Veeger NJ, Piersma-Wichers M, Tijssen JG, Hillege HL, van der Meer J.
Individual time within target range in patients treated with vitamin K
antagonists: main determinant of quality of anticoagulation and predictor of
clinical outcome. A retrospective study of 2300 consecutive patients with
venous thromboembolism. Br J Haematol. 2005 Feb;128(4):513-9
6. de Wit TR, van Mourik JA. Biosynthesis, processing and secretion of von
Willebrand factor: biological implications. Best Pract Res Clin Haematol. 2001
Jun;14(2):241-55
7. Dahlbäck B, Villoutreix BO. Regulation of blood coagulation by the protein C
anticoagulant pathway: novel insights into structure-function relationships and
molecular recognition. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005 Jul;25(7):1311-20
8. Ruf W, Dorfleutner A, Riewald M. Specificity of coagulation factor
signaling. J Thromb Haemost. 2003 Jul;1(7):1495-503
9. Ahamed J, Versteeg HH, Kerver M, Chen VM, Mueller BM, Hogg PJ, Ruf W.
Disulfide isomerization switches tissue factor from coagulation to cell
signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Sep 19;103(38):13932-7

Het doel van dit onderzoek is een beter inzicht te verkrijgen in het
stollingssysteem door middel van een gedetailleerde karakterisering en
kwantificering van de biosynthese en expressie van verschillende
stollingseiwitten in BOECs. De data verkregen in het onderzoek zullen
geïntegreerd worden in een rekenkundig model om het inzicht in het volledige
stollingssysteem te verbeteren, met als overkoepelend doel om parameters te
identificeren die het risico op het ontwikkelen van een bloedings- of
stollingsneiging in individuele patiënten te voorspellen.

De specifieke onderzoeksdoelen zijn:
1. Het kwantitatief en kwalitatief bepalen van de transcriptie en expressie van
endotheel specifieke bloedstollingscomponenten, waaronder VWF, TM, EPCR, PAR-1,
PDI, onder verschillende condities:
- onder normaal fysiologische condities,
- onder condities die in vivo aanleiding kunnen geven tot trombose (zoals bij
weinig zuurstof, met weinig voedingsstoffen, bij lage pH en in aanwezigheid van
ontstekingsmediatoren).
2. Het directe effect van de endotheliale stollingsfactoren op de bloedstolling
vaststellen door de BOECs te includeren in bestaande stollingsassays, zoals
onder andere in de trombinegeneratie assay [10,11].


Referenties (2)
10. Hemker HC, Al Dieri R, De Smedt E, Béguin S. Thrombin generation, a
function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost. 2006
Nov;96(5):553-61
11. Bos MH, Meijerman DW, van der Zwaan C, Mertens K. Does activated protein
C-resistant factor V contribute to thrombin generation in hemophilic plasma? J
Thromb Haemost. 2005 Mar;3(3):522-30

Selectie proefpersonen
Voor het onderzoek zal bloed worden afgenomen bij 50-100 gezonde, meerderjarige
vrijwilligers. Via advertenties zullen zij op de hoogte worden gebracht van het
onderzoek. De resultaten uit het onderzoek zijn van fundamenteel biochemische
aard en hebben geen directe, klinische betekenis. Gezien de aard van de
experimenten is het niet de verwachting dat er bepaalde toevalsbevindingen
worden gedaan. Er zullen dan ook geen resultaten aan de proefpersonen worden
teruggekoppeld, ook niet eventuele toevalsbevindingen. Aangezien de isolatie
van BOECs uit het bloed niet in alle gevallen succesvol is, zal de
proefpersonen gevraagd worden of ze bereid zijn op een later tijdstip nogmaals
bloed te laten afnemen (maximaal totaal drie keer).

Uitvoering en bloedafname
De vrijwilligers worden door middel van advertenties op de hoogte gebracht van
het onderzoek. Als deze proefpersonen aangeven geïnteresseerd te zijn in
deelname krijgen zij zowel schriftelijk als telefonisch informatie over het
onderzoek. Daarna wordt hen gevraagd naar het LUMC te komen. Nadat zij
schriftelijk toestemming hebben verleend voor deelname aan het onderzoek zal
50-100 ml citraatbloed worden afgenomen.

Codering van de bloedmonsters
De bloedmonsters van het onderzoek zullen worden gecodeerd, opdat
persoonsgegevens alleen bekend zijn bij de verantwoordelijke onderzoeker.
Laatstgenoemde heeft ook de sleutel tussen de code en de persoonsgegevens,
welke niet toegankelijk is voor andere medewerkers.


Bewerking van de bloedmonsters
De BOECs zullen in het Einthoven Laboratorium voor Experimentele Vasculaire
Geneeskunde worden geïsoleerd en in kweek worden gebracht. Vervolgens zullen de
gegenereerde endotheelcellijnen in vloeibare stikstof bewaard worden voor
verdere experimenten. De cellen zullen gedurende tien jaar bewaard blijven.
Voorts zal uit de cellen DNA geïsoleerd worden om de identiteit van bepaalde
endotheel componenten te bevestigen. Ook zullen mRNA niveaus van een aantal
eiwitten bepaald worden, evenals hun expressieniveaus. De BOECs zullen verder
worden gekarakteriseerd onder normale en protrombotische omstandigheden, dit
zal onder andere gebeuren door de cellen te includeren in bestaande
stollingsassays.


Ethische aspecten

Belasting voor de proefpersonen
De proefpersonen hebben niet direct belang bij het onderzoek. De studie zal
meer inzicht geven in de rol van endotheelcellen in bloedstolling, aangezien
deze gegevens zullen worden gebruikt voor het maken van een nieuw rekenkundig
model van de bloedstolling. De belasting voor de proefpersonen is minimaal; in
principe slechts eenmalige bloedafname, hoewel in enkele gevallen een tweede of
derde bloedafname gevraagd zou kunnen worden. De proefpersonen krijgen een
vergoeding voor de gemaakte reiskosten en een cadeaubon van ¤25 als dank voor
deelname. Omdat het slechts om bloedafname gaat, is het risico voor de
deelnemers verwaarloosbaar.

Informed consent
Deelnemers aan het onderzoek zullen vooraf zowel mondeling als schriftelijk
worden geïnformeerd over de studie. Proefpersonen zullen alleen geïncludeerd
worden nadat zij hier schriftelijke toestemming voor hebben gegeven. Alle
deelnemers kunnen zich voor informatie wenden tot Dr. W.M. Lijfering, Tel: 071
526 5639. Voor een onafhankelijk advies kunnen de deelnemers zich wenden tot
Dr. F.J.M. van der Meer, Tel: 071 526 3901.

Privacy
De bloedmonsters zullen zoals eerder beschreven gecodeerd worden en alleen de
verantwoordelijke onderzoeker Dr. M.H.A. Bos heeft toegang tot de sleutel
tussen deze code en de persoonsgegevens. Er zullen geen onderzoeksresultaten
aan de proefpersonen worden teruggekoppeld.

De belasting voor de proefpersonen is minimaal; in principe slechts eenmalige
bloedafname, hoewel in enkele gevallen een tweede of derde bloedafname gevraagd
zou kunnen worden. Omdat het slechts om bloedafname gaat, is het risico voor de
deelnemers verwaarloosbaar. Hooguit ontstaat er een blauwe plek door het
bloedprikken. Dit kan voorkómen worden door de prikplaats goed af te drukken.