Immuunmodulerende effecten van Inuline-type fructans in een hepatitis B vaccinatie studie

Gezondheids-bevorderende effecten van voedingsvezels staan de laatste jaren vol
in de belangstelling in de wetenschappelijke wereld. Voedingsvezels zitten in
vele producten zoals ontbijtgranen, brood, pasta en groenten. Hoog gedoseerde
voedingsvezel inname is geassocieerd met een verlaagd sterftecijfer in
patiënten die lijden aan hart-en vaatziekten, ziekten aan het verteringsstelsel
en niet-cardiovasculaire niet-kanker gerelateerde ontstekingsziekten (Jacobs et
al. 2007,Park et al. 2011,Chuang et al. 2012). Deze verbanden zijn gevonden in
zowel mannen als vrouwen en bestaan in de meeste landen, zelfs na zorgvuldige
correctie voor mogelijke confounding factoren (verstorende factoren) zoals
levensstijl en verschil in dagelijks voedingspatroon (Landberg. 2012). Helaas
zijn in al deze bovengenoemde studies alleen mengsels van verschillende
voedingsvezels getest in plaats van elke voedingsvezel apart te testen.
Hierdoor is het nu nog onbekend welke typen voedingsvezel aan deze effecten ten
grondslag liggen. Er is een dringende vraag naar onderzoek waarbij specifieke
voedingsvezels apart van elkaar getest worden (Landberg. 2012) om zo een beter
inzicht te krijgen in welke mechanismen en welke moleculen de gunstige
gezondheidseffecten bewerkstelligen. Er zijn verschillende typen voedingsvezel.
In deze studie zullen Inulin-type fructans (ITFs) en Resistant Starch Corn
(RSC) worden bestudeerd.
Inuline-type fructans (ITFs) zijn een specifiek soort voedingsvezels,
die vaak gewonnen worden uit chichorei wortel of suikerbieten. Wanneer deze
voedingsvezels aan het dagelijks dieet worden toegevoegd, wordt het
immuunsysteem in de darm gestimuleerd, treden minder infecties op en worden
zelfs symptomen van colitis (Leenen and Dieleman. 2007) en allergiën (Schouten
et al. 2011) verminderd. ITFs worden tegenwoordig in veel voedingsmiddelen
verwerkt. Voordat de gezondheidseffecten van ITFs bekend waren werden deze
vezels ook reeds vaak en op een veilige manier gebruikt als suiker- en
vetvervangers in light producten (Hidaka et al. 1991).
ITFs staan bekend als prebioticum, dat wil zeggen dat ze de groei en
functie van goede darmbacteriën bevorderen zoals lactobacilli (Leenen and
Dieleman. 2007,Casellas et al. 2007) en bifidobacteriën (Leenen and Dieleman.
2007,Lindsay et al. 2006). De gunstige effecten van deze vezels worden
toegeschreven aan de stimulatie van deze bacteriën en aan de toegenomen
concentratie in de darm van de fermentatie producten die de bacteriën
uitscheiden zoals korte keten vetzuren (Meijer et al. 2010,Vinolo et al. 2011).
Door de toename van deze bacteriën en hun korte keten vetzuren wordt het
immuunsysteem beïnvloed. Dit is onder andere te meten aan een toename in
Immuunglobuline A (IgA)-producerende plasma cellen (Guilliano et al. 2001,Woof.
2002), een toegenomen of verbeterde fagocytose (Nagl et al. 2002), en een
toename in de verhouding van T lymfocyten en Natural Killer cellen (Reid et al.
2003,Ouwehand et al. 2002).
Uit eigen recent onderzoek in onze groep blijkt echter dat ITFs niet
alleen indirect via bacteriën werken, maar dat ze ook direct immuuncellen
kunnen activeren. ITFs binden aan specifieke pattern recognition receptors
(PRR) op humane immuuncellen waardoor deze geactiveerd worden. PRRs zijn
belangrijke sensoren van het immuunsysteem en bepalen of een immuunreactie op
gang komt. De best gekarakteriseerde familie van PRRs is die van de Toll-like
receptoren (TLRs). In experimenten met humane reporter cellen voor TLRs hebben
we waargenomen dat ITFs specifieke TLRs aanschakelen, en met name TLR2. De
activatie van TLRs wordt als belangrijk gezien, omdat TLR signalering in
dendritische cellen in de darm er voor zorgt dat de opname en presentatie van
antigenen verhoogd wordt (Veldhoen et al. 2008)
waardoor er alerter en sterker gereageerd kan worden op ziekteverwekkers. In
onze resultaten was het waargenomen effect afhankelijk van de ketenlengte van
de gebruikte ITFs. Korte keten ITFs induceerden een meer ontstekingsremmend
effect op humane immuuncellen (leukocyten geïsoleerd uit bloed), terwijl lange
keten ITFs juist meer de immuunreactie stimuleerden. Met name in de ratio
IL-10/IL-12 vonden we verschillen, en deze ratio wordt vaak als maat genomen
voor de immuunbalans; wanneer deze hoog is is de respons ontstekingsremmend, en
wanneer deze laag is, is de respons meer immuun activerend. Onze data
suggereren niet alleen dat er directe effecten zijn op de immuuncellen maar ook
dat vezels met verschillende ketenlengtes mogelijk in vivo ook verschillende
effecten kunnen hebben op het immuunssysteem. Tijdens een practicum voor
bachelor studenten van Levenswetenschappen kon als onderdeel van het
immunologie onderwijsprogramma het eigen bloed geanalyseerd worden met behulp
van flow cytometrie. Wij hebben de studenten gevraagd of ze tijdens dit
practicum 8g per dag korte keten ITFs zouden willen consumeren als onderdeel
van hun practicum*. Uit de resultaten die de studenten vonden in dit experiment
bleek dat in deze kleine studie, bij een korte termijn inname van slechts 7
dagen reeds verschillende trends te zien waren in de immuuncel populaties; de
frequentie van T helper 1 (Th1) cellen en van regulatoire T cellen lieten
beide een verhoging zien ten opzichte van de eigen controle. Dit heeft ons
doen besluiten een groter experiment op te zetten om deze resultaten verder te
kunnen onderzoeken.

Het andere vezel supplement dat in deze studie wordt bestudeerd is RSC. Van
eerdere experimenten die zijn uitgevoerd in het UMCG en op de universiteit van
Wageningen op het gebied van Th1 en Th2 immune skewing is bekend dat RSC een
sterk Th1 stimulerend vezel is (zie hiervoor ook C2. Samenvatting amendement).
Resistant Starch is starch (zetmeel) dat niet verteerd wordt in de dunne darm,
en zodoende de dikke darm binnenkomt. Resistant Starch is een type
voedingsvezel dat in veel verschillende (plantaardige) voedingsproducten wordt
gevonden, zoals bonen, hele groenten, graanproducten en rijst. Er zijn vier
verschillende types resistant starch: RS1, RS2, RS3 en RS4. Inname van
resistent starch is mogelijk gunstig voor metabole (glycemische) controle en
reductie van eetlust (Robertson 2012, Bodinham 2010, Bodinham 2014). Ook is er
een rol in de reductie van inflammatie gesuggereerd (Higgins 2014, Moreau
2003). De fermentatie van resistant starch vindt met name plaats in het
proximale colon. De fermentatie van resistant starch resulteert in de productie
van short chain fatty acids (SCFAs) (Cummings 1987) Tot nu toe heeft er slechts
weinig onderzoek plaatsgevonden naar de potentieel immunomodulerende capaciteit
van resistant starch (Vos 2007). De keuze van het vezel RSC in dit vaccinatie
protocol vergroot het window om door het vezel gemediteerde toename van de
vaccinatie effectiviteit waar te nemen. Gezien de data van de experimenten die
in het UMCG en op de universiteit van Wageningen zijn uitgevoerd op het gebied
van Th1 en Th2 immune skewing, lijkt RSC een goed beargumenteerde keuze te zijn
om de Th1 respons te stimuleren.

Om meer robuuste en functionele effecten van ITF en RSC op het immuunsysteem
te kunnen aantonen, includeren we een vaccinatie studie in het huidige
protocol. Vaccinatie efficiëntie studies worden vaak gebruikt om
immuun-stimulerende effecten van voedingssupplementen te kunnen aantonen
(Olivares et al. 2007,Soh et al. 2010) en is daarom een geaccepteerd model om
de effecten van voesingsvezel op het immuunsysteem te testen. Omdat onze
resultaten laten zien dat ITFs TLR2 activeren, en bekend is dat deze receptor
betrokken is bij het stimuleren van opname van antigenen (Blander and
Medzhitov. 2006,Underhill et al. 1999), en tevens omdat we toegenomen trends
hebben waargenomen voor Th1 en regulatoire T cellen, verwachten wij dat ITFs
effectief kunnen zijn in het boosten van een vaccinatie repons. Wij verwachten
ook verschillen in de mate waarin dit gebeurt naar aanleiding van gebruik van
verschillende ketenlengte ITFs, uitgaande van onze IL-10/IL-12 resultaten in
humane leukocyten. Voor de hierboven beschreven redenen, verwachten wij ook dat
RSC de respons op vaccinatie kan boosten in een Th1 afhankelijke manier.
Een vaccinatie protocol waarbij het gunstig kan zijn om het
immuunsysteem een extra boost te geven is het protocol voor hepatitis B
vaccinatie. Dit vaccinatie protocol wordt gebruikt in het UMCG als een
verplichte vaccinatie voor derdejaars bachelor studenten van
Levenswetenschappen. Tijdens deze periode in de studie beginnen de studenten
Levenswetenschappen met hun onderwijs op het UMCG waarbij ze mogelijk in
contact kunnen komen met humaan materiaal. De hepatitis B vaccinatie is
verplicht, om garant te staan dat de studenten op een veilige manier met dit
materiaal kunnen werken. Omdat hepatitis B vaccinatie meestal een lage
efficiëntie heeft, worden in totaal drie vaccinatie injecties gegeven, voordat
pas een beschermende titer-waarde gemeten kan worden. Met name de eerste
injectie heeft een lage respons. Dit is echter voor ons onderzoek een voordeel
omdat er een groot potentieel ligt voor verbetering van deze respons.

*Vanwege het educatieve karakter van deze proef hebben wij bij navraag
bevestiging gekregen dat hiervoor nog geen METc aanvraag benodigd was.

De huidige studie heeft 1 primair doel en 1 secundair doel:

1: Het primaire doel van deze studie is om de effecten van ITF voedingsvezels
met verschillende ketenlengtes en RSC op hepatitis B vaccinatie efficiëntie te
analyseren. De belangrijkste parameter die bestudeerd wordt is de titeruitslag
van hepatitis B-specifieke antilichamen.

2: Om onderliggende mechanismen en gerelateerde processen te onderzoeken worden
ook de effecten op verschillende immuun cel populaties geanalyseerd. Om te
achterhalen of de veranderingen in immuunparameters gerelateerd zijn aan
veranderingen in de darmbacterie populaties zullen fecesmonsters worden
geanalyseerd , en tevens zal in deze monsters de hoeveelheid IgA en korte keten
vetzuren bepaald worden.

De onderzoeksopzet van deze interventie studie is een dubbel blind
gerandomiseerd placebo-gecontroleerde trial. Mannelijke en vrouwelijke
vrijwilligers worden gerecruteerd uit een populatie studenten die werkzaam zijn
op het Universitair Medisch Centrum Groningen (UMCG), en die een hepatitis B
vaccinatie nodig hebben om beschermd en veilig te kunnen werken met
patiëntenmateriaal. De leeftijdscategorie waar de vrijwilligers in vallen is 18
t/m 35 jaar. Gelijke aantallen van vrijwilligers worden random ingedeeld in de
volgende experimentele groepen: I) inname van 8g/d korte keten ITFs
(Frutafit®CLR), II) inname van 8g/d lange keten ITFs (Frutafit®TEX!), III)
inname van 8g/d resistant starch corn (RSC), IV) inname van 8g/d fructose, als
placebo. Fructose wordt in de wetenschappelijke wereld gezien als een geschikte
placebo controle. Alle supplementen worden aangeboden opgelost in 50ml
vezel-vrije limonade om smaak effecten te verbergen en om de manier van inname
te standaardiseren. Alle vrijwilligers zullen op dag 7 van de studie
gevaccineerd worden tegen hepatitis B, en in de 7 erop volgende dagen wordt
nogmaals dagelijks 8g van het vezelsupplement of de placebo ingenomen op
dezelfde wijze als hierboven beschreven, resulterend in een totale periode van
14 opeenvolgende dagen van supplement inname. Deze timing van supplement inname
is gebaseerd op literatuur waaruit blijkt dat vaccinatie protocollen het meeste
voordeel kunnen krijgen uit het stimuleren van de immuunrespons vlak voor en
vlak na het moment van vaccinatie omdat deze periode cruciaal is voor het
opwekken van de antilichaam reactie. De vrijwilligers worden gevraagd om
gedurende het hele verloop van de studie (35 dagen) een voedingsdagboek bij te
houden en om tijdens deze 35 dagen af te zien van inname van andere pre- of
probiotische voedingssupplementen buiten de dagelijkse studiesupplementen.
Naast hepatitis B titer ontwikkeling als de primaire studieparameter, zullen we
ook de effecten van de interventie bepalen op perifere immuuncel populaties.
Hiertoe zullen basis bloedmonsters worden afgenomen van alle vrijwilligers voor
de start van supplement inname (dag 0) en vervolgens zullen bloedmonsters
worden afgenomen op dag 7 (voorafgaand aan vaccinatie), dag 14, 21 en 35 (op
elk tijdspunt zal 10ml bloed per persoon worden afgenomen en opgevangen in
heparine buizen. Bloedafname wordt uitgevoerd door getrainde professionals van
de afdeling Laboratorium Geneeskunde van het UMCG. Om populaties van
immuuncellen in perifeer bloed te bestuderen worden witte bloedcellen uit heel
bloed aangekleurd met antilichamen voor relevante populatiemarkers en
geanalyseerd met behulp van flow cytometrie. T cel responsen worden verwacht om
vanaf 4 dagen na vaccinatie op te komen. Daarom worden de T cel responsen in de
bloedmonsters van de vrijwilligers geanalyseerd op dag 0 als basaal monster, en
op dag 7 en dag 14 om responsen in de tijd te kunnen zien. De hepatitis B
antilichaam titers zullen worden geanalyseerd in de bloedmonsters die worden
afgenomen op dag 21 en 35 van de studie (dit is 14 en 28 dagen na vaccinatie),
om de titer respons in de tijd te kunnen meten. Deze meting zal worden gedaan
met hepatitis B antilichaam-specifieke ELISA microtiter platen. Tenslotte
worden de vrijwilligers gevraagd om wekelijks een feces monster in te leveren,
waarin de samenstelling van bacteriepopulaties, de korte keten vetzuren en de
IgA zal worden bepaald. Het eerste monster zal worden verzameld op dag 0 en het
laatste monster op dag 35, in totaal 6 monsters.

De vrijwilligers in deze studie nemen gedurende 14 dagen, dagelijks een voedingsvezelsupplement (korte of lange keten ITF of RSC) of placebo (fructose) in, en deze vier test substanties zijn veilige middelen die algemeen als commercieel verkrijgbaar voedingsmiddel gebruikt worden, zonder enige negatieve bijwerkingen. De vrijwilligers nemen per dag 8g van vezelsupplement of placebo in, welke zijn opgelost in 50ml vezel-vrije limonade, door deze oplossing op te drinken. Deze dosis is afgestemd op de literatuur, waarbij een dosis van 8g per dag een effectieve dosis is om het immuunsysteem te stimuleren (Gibson et al. 1995,Langlands et al. 2004). Tijdens een practicum voor educatieve doeleinden is gebleken dat met deze dosis verschillen in perifere immuunpopulaties konden worden gemeten na 7 dagen en dat deze dosis probleemloos is in te nemen.

Het verzamelen van feces monsters brengt geen risico mee voor de proefpersonen.
Bloedafname zal uitgevoerd worden door getrainde professionals van de afdeling
Laboratorium Geneeskunde van het UMCG en zal steeds bestaan uit 1 buis per
persoon per tijdspunt met een volume van 10ml. In totaal zal 50ml bloed worden
afgenomen verspreid over een periode van 35 dagen. Bloedafname zal plaatsvinden
aan de mediane cubitale vene aan de binnenkant van de elleboog. Dit kan een
kleine bloeduitstorting veroorzaken op de plek van bloedafname, maar in het
algemeen gebeurt dit niet wanneer direct na bloedafname druk wordt uitgeoefend
op deze plek voor een korte tijd (ca.1 min.). De hepatitis B vaccinatie die
tijdens deze studie plaatsvindt, is onderdeel van een veilig en geodgekeurd
vaccinatieprogramma dat al meerdere jaren loopt. Omdat de onderzoekspopulatie
geselecteerd is op vrijwilligers die deze vaccinatie sowieso nodig hebben voor
het veilig kunnen werken met patiëntenmateriaal tijdens hun studie op het UMCG,
brengt dit voor de groep vrijwiligers geen extra belansting met zich mee. De
beschikbaarheid van het vaccin hangt op geen enkele manier samen met deelname
aan dit onderzoek. Er zijn geen voordelen voor de vrijwilligers die deelnemen
aan deze studie. De toegevoegde waarde van deze humane studie is een toename in
kennis van voedingsvezelinname op het immuunsysteem en in het geval dat de
voedingsvezels zorgen voor een verbeterde vaccinatie-respons kan overwogen
worden om in het vervolg aan te bevelen de voedingsvezels in te nemen rondom de
eerste injectie van dit vaccinatieprogramma.
Daarnaast kan dit onderzoek belangrijke informatie verschaffen over de
onderliggende of bijkomende immunologische effecten van voedingsvezelinname op
de perifere immuuncel populaties en kan kennis worden opgedaan over de
mogelijke correlatie tussen voedingsvezelinname en het effect op modulatie van
darmbacterie populaties, korte keten vetzuur productie en IgA in de feces.