In Vitro Karakterisering en functionele verrijking van de HIV-specifieke CD8 + T-cellen

Antigeen-specifieke cytotoxische CD8 + T cellen worden beschouwd als
belangrijke spelers in de beschermende immuunreactie tegen acute en chronische
virale infecties. Uit verschillende studies blijken CD8+ T cellen een
sleutelrol te spelen bij infecties met het humane immunodeficiëntie virus
(HIV). Hoewel de immuunrespons van HIV geïnfecteerde individuen jarenlang de
HIV replicatie onder controle kan houden, zal uiteindelijk HIV-specifieke CD8 +
T cellen falen in het verwijderen of controleren van de HIV-infectie waardoor
AIDS ontstaat. De vraag rijst of dit falen van HIV-specifieke CD8 + T-cellen om
langdurige HIV uit te roeien of te beheersen leidt tot uitputting van
HIV-specifieke CD8 + T-cellen met functioneel verlies van virus-specifieke CD8
+ T-cellen bij chronische virale infecties tot gevolg. Mechanismen welke
genactiviteit regelen omvatten epi-genetische modificatie en post-transcriptie
regulatie. Epi-genetische modificatie leidt tot veranderingen in chromatine
structuur door middel van methylering van DNA en modificatie van histonen.
Epi-genetisch gemedieerde gen-silencing werd onlangs ook gekoppeld aan CD8 + T
cel uitputting. Aangezien epi-genetische veranderingen reversibel zijn, kunnen
remmende enzymen die betrokken zijn bij epi-genetische veranderingen een nieuwe
aanpak zijn om de functie van T-cellen te moduleren bij virale infecties.
Post-transcriptionele regulatie is een ander mechanisme om de gen activiteit te
controleren. Tot dus ver zijn microRNA, lang niet-coderend RNA, en RNA-bindende
eiwitten betrokken bij veranderde genexpressie in een netwerk van silencing
mechanisme zoals translatie, mRNA destabilisatie, voorkoming van degradatie en
modulerende lokalisatie. Er is zeer weinig bekend over de rol die deze
post-transcriptionele regulatoren spelen bij immuunresponses en specifieke
cytotoxische CD8 + T-cellen, hoewel dysregulerende post-transcriptionele
regulatoren kunnen bijdragen tot het uitgeputte fenotype van HIV-specifieke CD8
+ T-cellen. In deze studie analyseren we het epi-genetisch remmende effect op
HIV- en CMV-specifieke CD8 + T-cel functies. Ook zullen we de expressie
profielen van verscheidene post-transcriptionele regulatoren in HIV- en
CMV-specifieke CD8 + T-cellen van HIV-geïnfecteerde controles karakteriseren.
We maken van het voordeel gebruik om twee verschillende virus-specifieke CD8+
T-cellen te analyseren in dezelfde HIV-geïnfecteerd individu: HIV-specifieke
CD8 + T cellen zijn uitgeputte virus-specifieke CD8 + T-cellen welke niet in
staat zijn een chronische virus infectie te controleren en CMV-specifieke CD8+
T-cellen welke succesvol een chronische CMV infectie beheersen. Dit maakt het
mogelijk om direct het effect van epi-genetische remmers en de expressie van
post-transcriptionele regulatoren in beide CD8+ T-celpopulaties te vergelijken
en welke werking het gedrag van de defecte HIV-specifieke CD8 + T-cellen zal
herstellen tot het niveau van de succesvolle CMV-specifieke CD8 + T-cellen.

1. Onderzoeken of epi-genetische remmers uitputting van HIV-specifieke CD8+
T-cellen kan keren.
2. Onderzoeken of HIV-specifieke CD8+ T-cellen een veranderde
post-transcriptionele regulatoren expressie hebben.

In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van perifeer bloed dat is verkregen via
venapunctie van HIV geïnfecteerde individuen. In vitro experimenten worden
uitgevoerd op geïsoleerde lymfocyten. Chronisch HIV-geïnfecteerde vrijwilligers
wordt gevraagd om bloed te doneren (maximaal 50 ml, 5 buizen) ofwel tijdens hun
arts bezoek of tijdens een gepland bezoek voor bloeddonatie. PBMC worden
geïsoleerd uit perifeer bloed en geanalyseerd of gekweekt in vitro. Voor de
epi-genetische inhibitor studies zullen we PBMC in kweek behandelen met
verschillende epi-genetische remmers waarna het fenotype en de functie van
HIV-specifieke en CMV-specifieke CD8 + T-cellen worden geanalyseerd. Het
fenotype van HIV-specifieke CD8 + T-cellen wordt onmiddellijk na isolatie of na
peptide stimulatie bepaald door flowcytometrie (memory differentiatie, cytokine
productie en remmende receptor expressie). In sommige gevallen zal
HIV-specifieke CD8 + T-cellen met peptide worden gestimuleerde en proliferatie
worden gemeten. In sommige experimenten zullen we de snelheid van celdood van
HIV-specifieke CD8 + T-cellen onderzoeken. Voor het onderzoek naar
post-transcriptionele regulatoren zullen we HIV- en CMV-specifieke CD8 +
T-cellen uit PBMC sorteren en m.b.v. RT-PCR en RNAseq zullen we de expressie
van geselecteerde post-transcriptionele regulatoren (miRNA, lncRNA en RBP)
analyseren. Voor sommige post-transcriptionele regulatoren, zullen we de
intracellulaire expressie meten m.b.v. flowcytometrie als de test beschikbaar
is.

Er zijn geen voordelen voor deelnemers aan dit in vitro onderzoek. Het enige
potentiële risico van deelname aan deze studie is het geringe risico verbonden
aan bloeddonatie door middel van venapunctie.