Biomarker identificatie van de stralingsreactie na radionuclide therapie.

PRRT met 177Lu-DOTATATE is een vorm van interne bestralingsbehandeling voor
patiënten met een neuro-endocrine tumor om de tumor groei te reduceren en de
ziekte te stabiliseren. Helaas is de objectieve respons gelimiteerd en behaalt
minder dan 1% van de patiënten complete remissie door deze behandeling. Het
toedienen van een hogere cumulatieve dosis kan mogelijk zorgen voor meer
toxiciteit van gezond weefsel en is waarschijnlijk nadelig voor de patiënt. Om
de behandeling te verbeteren is het nodig om de onderliggende moleculaire
mechanismen te begrijpen zoals de cellulaire respons van gezonde cellen op de
straling. Een beter begrip van de response, zoals transcriptionele effecten en
DNA schade, kan bijdragen aan identificatie van biomarkers voor toxiciteit
en/of effectiviteit. Dit is gezien bij externe bestraling waar
stralingsgevoelige genen zijn geïdentificeerd in ex vivo bestraalde
bloedcellen. Deze genen waren up- of down- gereguleerd volgens in vivo
blootstelling aan bestraling van het hele lichaam. Dit laat zien dat ex vivo
data een goede predictor kan zijn van in vivo blootstelling.

PRRT induceert verschillende soorten DNA schade in kankercellen en in gezond
weefsel, dubbel strengs DNA breuken (DSB) zijn het meest schadelijk voor de
cel. Radiatie geïnduceerde foci (RIF) van een DSB kan worden gevisualiseerd met
de biomarkers γ-H2AX en 53BP1. Verschillende studies hebben een goede
correlatie laten zien tussen stralingsdosis in bloed en het aantal DSB in
peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) voor verschillende behandelingen die
overeen komen met PRRT. Een bloedafname een relatief niet-invasieve manier om
aan deze informatie te komen.

In PBMCs van 16 patienten die behandeld zijn met 177Lu-DOTATATE het gemiddelde
aantal RIF per cel vermeerderde in de eerste uren na behandeling en daalde
significant 5 uur na behandeling.
Dit illustreert het ioniserende effect op PBMCs na PRRT als functie van de
geabsorbeerde dosis van het bloed en geeft een duidelijk begrip van de
correlatie tussen het gemiddeld aantal RIF per cel en de geabsorbeerde dosis in
het bloed.

Schumann et al. heeft gekeken naar DNA schade en herstel in PBMCs van patienten
die behandeld zijn met [131I]NaI. Ze laten zien dat DNA schade herstel na
interne bestraling met lage dosering hetzelfde patroon volgt als ex vivo
bestraling met hoge dosering. Omdat 177-lutetium en 131-Iodine allebei beta-
emitters zijn, is analyse naar DSB in PBMCs een geode method om de dosis
respons van PRRT te analyseren.

Blootstelling aan ioniserende straling (IR) leidt tot complexe cellulaire
reacties zoals veranderingen in gen expressie die kan verschillen tussen
individuen. In vivo blootstelling aan x-ray laat een transcriptionele
stralingsgeïndiceerde reactie zien na 24 uur voor de genen APOBEC3H en FDXR,
samen met een sterke dosis-afhankelijke reactie in het bloed wat ex vivo
bestraald is. De expressie van FDXR was significant ge-upreguleerd 24 uur na
radiotherapie en er werd geen significant verschil gezien tussen in vivo en ex
vivo bestraald bloed. Dit laat de mogelijkheid zien om biomarkers te
identificeren in PBMCs die iets kunnen zeggen over de reactie op straling.

Bovenstaande resultaten laten zien dat ex vivo bestraling de in vivo
transcriptionele regulatie en DNA schade kan nabootsen en dat dit gemeten kan
worden in PBMCs. Deze studie met 177Lu-DOTATATE kan ons meer leren over de
stralingseffecten en kan ons mogelijk ook informatie geven over biomarkers voor
effectiviteit en toxiciteit.

Naast gezonde cellen zullen we ook kijken naar de respons van tumorcellen op
PRRT door gebruik te maken van ctDNA. We willen de mogelijkheid onderzoeken om
ctDNA in NET patiënten te detecteren aangezien er pas één studie is
gepubliceerd waar dit wordt gedaan. Vergelijkbaar met de resultaten bij andere
maligniteiten, verwachten we dat de detectie van ctDNA informatie kan geven
over therapeutische respons, evaluatie van de tumor grootte en
ziekteprogressie. ctDNa bevat genetische informatie van tumorcellen uit
verschillende regio*s (primaire tumor en metastasen) en is het resultaat van
celdood. Dit maakt dat dit meer representatief is voor de ziekte dan een biopt
van één plek. Ook is een bloedafname minder invasief dan een biopsie. De
aanwezigheid van ctDNA in het bloed van NET patiënten is geassocieerd met een
slechte prognose is een kleine, heterogene patiënten populatie.
Irradiatie van de tumor kan leiden tot tijdelijke toename van de afgifte van
ctDNA is lonkanker muismodellen die behandeld werden met externe bestraling.
Dit wijst erop dat verandering in ctDNA levels vroeg na de bestraling een
voorspelling kunnen geven op de therapie uitkomst en zo mogelijk de therapie in
een vroeg stadium aan te passen indien nodig. Azad et al. heeft laten zien in 4
patiënten met oesophaguskanker die chemoradiatie kregen dat de aanwezigheid van
ctDNA geassocieerd was met tumor progressie, vorming van metastasen en een
kortere ziekte-specifieke overleving.

Er zijn verschillende onderzoeken gedaan waarin mogelijke genetische
afwijkingen in het ctDNA kunnen worden opgespoord. Het onderzoek naar ctDNa in
NETs wordt op dit moment belemmerd door de afwezigheid van vaak terugkerende
genetische variaties in deze populatie (zoals TP53). Recent is het genoom van
NET patiënten geanalyseerd in de CPCT studie. Hieruit blijkt dat het nog steeds
een uitdaging is om een (set van) makers te identificeren die in alle
NET-subtypes gedetecteerd kunnen worden. Methylatie sequencing kan een
mogelijkheid bieden om te kijken naar epigenetische markers in een groter deel
van het tumor genoom vergeleken met benadering van mutaties. Ook hebben deze
markeringen hebben in het algemeen een hogere penetratie in de tumor.
Anti-kanker behandelingen kunnen deze methyleringspatronen beïnvloeden en zo
kan de behandelrespons gemonitord worden. Liao et al. heeft 41 patiënten
onderzocht met hepatocellulair carcinoom (HCC) voor en na chirurgie. In 8 van
deze patiënten werden tumor-geassocieerde mutaties gevonden in ERT, CTNNB1 en
TP53 in ctDNA. Patiënten met deze mutaties in ctDNA hadden vaker een recidief.
Een prospectieve klinische studie heeft post-operatief ctDNA methylatie markers
(WIF1 en NPY) geëvalueerd in 805 patiënten met colorectaal carcinoom (CRC). De
2-jaars ziekte vrije overleving was significant lager in de groep waar ctDNA
gedetecteerd werd (64%) dan in de ctDNA-negatieve groep (82%). In 87 patiënten
met borstkanker die behandeld werden met neoadjuvante chemotherapie,
gemethyleerd ctDNA werd gedetecteerd gebaseerd op hypermethylatie van de
RASSF1A promotor. Gemethyleerde ctDNA levels waren significant gecorreleerd aan
de grootte van de tumor massa. Samengevat kan ctDNA, naast PBMCs, een manier
zijn om de tumor respons op PRRT te monitoren op een minimaal invasieve manier.

Dit is een pilotstudie om de mogelijkheid te valideren om het effect van PRRT
met 177Lu-DOTATATE op transcriptionele regulatie en DNA-schade-inductie in
PBMC's te bepalen en hoe dit gerelateerd is aan de stralingsdosis.
Ook willen we weten of we ctDNA kunnen detecteren in NET patiënten om
vervolgens te kijken naar het effect van PRRT op ctDNA.

Het betreft een prospectieve pilot studie. Na de informed consent procedure
wordt er bloed afgenomen bij 25 patiënten die PRRT krijgen vanwege een
gevorderde neuro-endocriene tumor.

De bloedafnames vinden plaats op de volgende momenten:
- op baseline (vooraf aan PRRT)
- 4 uur na toediening van PRRT
- 24 uur na toediening van PRRT
- voorafgaand aan de tweede cyclus PRRT (8 weken na de 1e cyclus zoals gepland)

De PRRT wordt gegeven met een interval van 8 weken tussen de cycli (standaard
behandeling) en de studie is voltooid na de laatste bloedafname.
DNA schade en transcriptionele profielen in PBMCs en ctDNA worden geanalyseerd
en gecorreleerd aan de stalingsdosis in het bloed.
Er wordt bloed verzameld op 4 tijdspunten voor in vivo analyse. De uitslagen
zullen worden vergeleken met de kliniek van de patiënt.
Inclusie van patiënten en de bloedafnames zullen plaatsvinden in het ENETS
Centre of Exellence, Erasmus Medical Center, Rotterdam, The Netherlands.

Radioactieve dosis zal bepaald worden door meting met de gamma-counter. DNA
schade wordt beoordeeld met immunofluorescentie kleuring en microscopie.
Straling geïnduceerde foci van tenminste 50 per cel van tenminste 4 *fields of
view* per sample worden gekwantificeerd door gebruik te maken van een
automatische kwantificatiemacro in ImageJ.
Transcriptionele profielen worden beoordeeld middels nanopore sequencing. RNA
isolatie, sequencing, analyse en qPCR validation worden gedaan in Radiation
Effects Department of UK Health Security in Oxfordshire, United Kingdom.
Validatie van de geïdentifieerde tot expressive gebrachte genen zullen worden
gedaan middels qPCR. Voor sequencing gebruiken we een unieke *in-house* analyse
waar we gebruik maken van een Snakemake pijplijn. Straling geïnduceerde foci en
sequencing analyse worden blind uitgevoerd.
Voor de beoordeling van de circulerende biomarkers van tumor cellen zullen we
ctDNA levels meten in het bloed voor PRRT en 8 weken na de eerste cyclus. DNA
methylatie sequencing zal gedaan worden. De MeD-seq assay zal gebruikt worden
voor genoom-brede DNA methylatie profilering op cell-vrij DNA (cfDNA).

De handelingen bestaan uit bloedafnames op vier tijdspunten tijdens opname voor
de PRRT. De belasting en risico's zijn beide laag aangezien er geen
interventies gedaan worden en een bloedafname een geringe belasting is.