In vitro activatie van monocyten van zwangere vrouwen door verschillende typen bacteriële lipopolysacchariden leiden tot veranderingen in de immuunrespons

Uit de literatuur blijkt dat er een relatie bestaat tussen
zwangerschapscomplicaties en aanwezigheid van een infectie bij de moeder
tijdens de zwangerschap. Een voorbeeld hiervan is de aangetoonde associatie
tussen vaginose en vroeggeboorte. Er is groeiend bewijs dat parodontitis
tijdens de zwangerschap een risicofactor is voor het ontwikkelen van
zwangerschapscomplicaties zoals vroeggeboorte en pre-eclampsie. Parodontitis is
een ernstige en destructieve ontsteking van de omliggende weefsels van de
gebitselementen, veroorzaakt door een vnl. uit gram-negatieve bacteriën
bestaande mengflora. Hoewel er meer dan 500 bacteriesoorten in de mondholte
geïdentificeerd zijn, blijkt de aanwezigheid van slechts een kleine selecte
groep paropathogene bacteriën, zoals Fusobacterium nucleatum, Tannerella
forsythensis, Prevotella intermedia, Treponema denticola, Micromonas micros en
Porphyromonas gingivalis, een rol te spelen bij het ontstaan van parodontitis.
Gram-negatieve bacteriën bevatten lipopolysacchariden (LPS) in hun celwand die
het immuunsysteem aanzetten tot productie van pro-inflammatoire cytokines,
zoals IL-1 en TNF-α. Met name P. gingivalis is in staat tot productie van grote
hoeveelheden LPS. Er is in toenemende mate aandacht voor de rol van LPS op de
immuunrespons tijdens de zwangerschap. In het verleden is al aangetoond dat
infusie van LPS van de enterobacterie E. coli in een extreem lage dosis
resulteert in een pre-eclamptisch syndroom in de zwangere rat, gekenmerkt door
o.a. hypertensie en proteïnurie. Dit syndroom is specifiek voor de
zwangerschap: op identieke wijze behandelde niet-zwangere ratten vertonen deze
symptomen niet. Dit geeft aan dat zwangere ratten veel gevoeliger zijn voor LPS
dan niet zwangere ratten.
In onze recent uitgevoerde ratstudie *The effect of Porphyromonas gingivalis
lipopolysaccharides in pregnant rats: a pilot study* hebben wij bovengenoemd
onderzoek herhaald met LPS van P. gingivalis om een eventuele rol van deze
lipopolysacchariden in de pathogenese van pre-eclampsie nader te onderzoeken.
De resultaten van onze studie laten zien dat LPS van P. gingivalis leidt tot
groeivertraging van de placenta en de foetus, en ook leidt tot hypertensie,
maar niet een echt pre-eclamptisch syndroom in de zwangere rat induceert. LPS
van verschillende soorten bacteriën lijken dus verschillende effecten op de
zwangerschap hebben. Of voor deze soort LPS ook geldt dat zwangere ratten
gevoeliger zijn voor LPS dan niet-zwangere ratten, moet nog blijken uit een
vervolg-studie.
Het immuunsysteem herkent LPS van verschillende bacteriesoorten met behulp van
specifieke patroon-herkenningsmechanismen (de zgn. toll-like receptoren) op de
celwand van monocyten. Tot nu toe zijn 13 verschillende toll-like receptoren
geïdentificeerd, waarvan TLR-4 en TLR-2 het meest bestudeerd zijn. TLR-4
herkent LPS van veel gram-negatieve bacteriën, o.a. dat van E-coli. TLR-2
herkent vooral peptidoglycaan van gram-positieve bacteriën, maar recente
onderzoeken laten echter zien dat het LPS van de gram-negatieve bacterie P.
gingivalis TLR-2 activeert en niet TLR-4. Dit laatste gegeven zou kunnen worden
verklaard door het feit dat de chemische structuur van het lipide A van het LPS
van P. gingivalis afwijkend is van dat van LPS van E. coli. Activatie van een
specifieke toll-like receptor zal de monocyt aanzetten tot een gemoduleerde
immuunrespons. Activatie van TLR-4 leidt tot productie van cytokines die de
cellulaire immuunrespons stimuleren, de zg Th1 cytokines. Voorbeelden hiervan
zijn IL-1, IL-6 en TNF-α. De activatie van TLR-2 leidt tot de productie van
cytokines die een humorale immuunrespons stimuleren, de zg Th2-immuunrespons.
Voorbeelden hiervan PGE2, IL-4, IL-5, IL-10 en IL-13. Een Th2-respons lijkt
een voorwaarde te zijn voor een succesvolle zwangerschap. Volgens de huidige
theorieën zou de Th1-/Th2-ratio tijdens de zwangerschap veranderd zijn ten
gunste van de Th2-cytokines. Men denkt dan ook dat Th1-immuniteit niet
compatibel is met zwangerschap. Een pathologische zwangerschap, zoals bv
pre-eclampsie, is dan ook geassocieerd met een shift in Th1-Th2 ratio richting
Th1. Hoe de shift richting Th1 tijdens pre-eclampsia bewerkstelligd wordt is
nog onbekend. Wellicht speelt de activatie van verschillende toll-like
receptoren (als gevolg van een door een paropathogene mengflora veroorzaakte
infectie, zoals bv parodontitis) een rol in het activeren van verschillende
immunologische reacties. Uit onze proefdier-experimenten zouden we kunnen
concluderen dat LPS van gram-negatieve bacteriën die TLR-4 activeren
pre-eclampsie-achtige verschijnselen (hypertensie en proteïnurie) opwekken,
terwijl LPS van gram-negatieve bacteriën die TLR-2 activeren, alleen
hypertensie en groeivertraging induceren. Het huidige project is er dan ook op
gericht om te toetsen of de expressie van TLR-4 and TLR-2 op monocyten
verandert tijdens de zwangerschap. Daarnaast willen we bestuderen of
verschillende soorten LPS van verschillende gram-negatieve bacterien (zoals E.
coli en P. gingivalis) monocyten stimuleren tot productie van Th1 of Th2
cytokines. Gezien de verhoogde gevoeligheid van zwangere individuen voor LPS,
willen we ook bestuderen of de cytokine-productie van monocyten na stimulatie
met verschillende soorten LPS verandert tijdens de zwangerschap.

Doel van deze studie is met behulp van sonicaten van verschillende soorten
mondbacteriën en geïsoleerd LPS (als in vitro ontstekings-stimuli) inzicht te
krijgen in cytokine-productie en expressie van toll-like receptoren op
monocyten in bloedmonsters van zwangere en niet-zwangere vrouwen.

Bij 20 zwangeren zullen bij routine-bloedafname bij 30 weken zwangerschap twee
buisjes bloed worden afgenomen. Bij 20 age-matched, niet-zwangere controles
zullen twee buisjes bloed worden afgenomen in de folliculaire fase van de
menstruele cyclus. Van beide groepen (zwangeren en niet-zwangeren) zal in
volbloed (ongestimuleerd) mbt fluoriserende antilichamen gekeken worden naar de
expressie van TLR-2 en TLR-4 op de monocyt. Het aantal monocyten dat deze TLR*s
tot expressie brengt en de dichtheid van de expressie zal worden gemeten met
behulp van flow cytometrie. Voor het bepalen van de cytokine-productie van
zwangere en niet-zwangere monocyten zullen de bloedmonsters in vitro worden
gestimuleerd met sonicaten van verschillende soorten orale paropathogene
bacteriën en verschillende doseringen LPS van E. coli en P. gingivalis. Na
stimulatie zal de productie van verschillende soorten cytokines (zoals oa IL-1
beta, IL-6, IL-10, IL-13, IL-18 en TNF-alfa) gemeten worden (flow cytometrie/
ELISA). Ook zal gekeken worden naar recent ontdekte, nieuwe interleukines IL-23
en IL-27 (IL-12 familie) die geassocieerd worden met een Th1-immuunrespons en
een verstoorde placentaire implantatie.

Voor de bloedbepalingen zal gebruik worden gemaakt van tijdens de zwangerschap
afgenomen bloedmonsters (routine-bloedmonsters bij 30 weken zwangerschap). Voor
dit doel zullen bij de routine-bloedafname twee buisjes extra buisje bloed
worden afgenomen. Aan de controles zal worden gevraagd om éénmalig twee buisjes
bloed af te staan in de folliculaire fase. Om ernstige parodontitis èn de
aanwezigheid van orale pathogene micro-organismen uit te sluiten zal bij alle
deelneemsters een snelle screening van het tandvlees (met behulp van de
DPSI-score) worden uitgevoerd en zullen subgingivale plaque-samples worden
afgenomen. Het vaststellen van de DPSI-score en het afnemen van de
plaque-samples brengen geen risico*s met zich mee.