Rubinstein-Taybi syndroom en keloiden

Het Rubinstein-Taybi Syndroom (RTS) is een syndroom gekenmerkt door multipele
congenitale afwijkingen en intellectuele achterstand. Dit syndroom wordt
veroorzaakt door mutaties in CREBBP en zijn homoloog EP300. Een van de
complicaties van RTS is de vorming van keloiden in 25-30% van de patienten.
Keloiden zijn proliveratieve tumoren die ontstaan door een excessieve reactie
van de huid op een trauma. Bij RTS patienten kan een kleine huidverwonding al
resulteren in de vorming van keloiden. Keloiden kunnen de kwaliteit van leven
ernstig beinvloeden doordat ze klachten van jeuk en pijn veroorzaken.

Er zijn hypotheses (verstoorde HAT activiteit; verstoorde TGFbeta signalling
pathway) over de verstoring in functie van CREBBP/EP300 die leidt tot
littekenvorming. Het doel van dit onderzoek is deze hypotheses te toetsen dmv
moleculair-biologisch onderzoek in huidbiopten, en om gedetailleerde klinische
informatie over keloïden bij patiënten met RTS te verkrijgen. Indien een van de
hypothese juist blijkt zal in een vervolgonderozke medicamenteus geprobeerd
worden keloïden te voorkomen of groei in bestaande keloïden te stoppen. Deze
trial zelf is geen onderdeel van deze aanvraag.

Literatuur studie
a: RTS
b: Keloiden
c: Keloiden in RTS
d. Keloiden in RTS en jeuk

Klinische studie:
1: Alle RTS patienten die bekend zijn bij de patienten verenigingen in
Nederland, Noorwegen en United Kingdom zullen worden uitgenodigd om deel te
nemen aan de studie via de desbetreffende patienten verenigingen.

2: Ouders/ andere wettelijk verantwoordelijken avn de RTS patienten met
keloiden kunnen aangeven deel te willen nemen via een speciaal e-mail adres.
3: Er zal worden gekeken of bij deze patienten de mutatie bekend is (bij ong
3/4 van de patienten bekend)

4: Iedereen zal worden uitgenodigd om de polikliniek te bezoeken (in het
desbetreffende land). De familie zal opnieuw op de hoogte worden gesteld van de
studie en de mogelijkheid krijgen om vragen te stellen. Tevens worden zij
gevraagd het informed consent te tekenen.

5: De klinische geschiedenis zal worden uitgevraagd middels 3 vragenlijsten
(keloid; RTS; jeuk) die voor het polikliniek bezoek al worden toegestuurd aan
de deelnemende families. Additionele vragen kunnen worden beantwoord.

6: Lichamelijk onderzoek zal worden uitgevoerd en de POSAS (Patient and
Observer Scar Assessment Scale) zal worden afgenomen. Drie dimensies van het
keloid zullen worden gemeten met een meetinstrument. Gestandaardiseerde foto's
zullen worden genomen van de borst, schouders en rug. 10cc bloed zal worden
afgenomen voor bepaling van jeuk parameters en indien nog niet bepaald, de
moleculaire achtergrond van RTS.

7: Biopsieen (2mm) zullen worden afgenomen van 5 RTS patienten op 3
verschillende plaatsen:gezonde huid, actieve rand van het keloid met de gezonde
huid en van het centrum van het keloid. Over de precieze plek zal van te voren
overleg zijn tussen de arts en de patient/ familie. Alle biosieen worden
afgenomen tijdens een narcose die patient om een andere reden krijgt. De
biopsieen zullen worden opgeslagen mbv HAM F10 of een soortgelijk medium en
binnen 24 uur naar het laboratorium gestuurd. Er zullen foto's worden genomen
van de biopsie plaatsen, voor en na de biospie. Follow-up wordt aangeboden aan
de 5 patienten 6 en 12 maanden na de biopsie, om te bekijken hoe de plaatsen
zich ontwikkelen. Er zal opnieuw gemeten worden en er zullen foto's worden
gemaakt.

Moleculaire studie:
a: Een deel van het biopsie materiaal wordt gebruikt om fibroblasten te kweken
volgens een gestandaardiseerd protocol.
b: Andere delen van het biopsie materiaal worden ingevroren voor mRNA en eiwit
expressie studies op de specifieke delen van de huid (normale huid, rand
keloid-normale huid en keloid). Dit gebeurt ook na 1, 3 en 6 passages van de
fibroblastenkweek.
c: Expressie studies van CREBBP en EP 300 in de ingevroren biopten mbv
quantitatieve PCR.
d: Transcriptome analyse in zowel gekweekte cellen als ingevroren biopten op
mRNA mbv deep sequencing (Illumina/ Solexa). Data analyse zal worden
uitgevoerd (fold-change berekeningen, standaard statistische tests, ANOVA
analyse en clustering). Bij de analyse van functie van differentially regulated
genen sets zal gebruik worden gemaakt van Bioconductor en in-house software.
Dit vraagt de Gene Ontology databases en bepaalt of ge-dereguleerde genen over
gepresenteerd worden. Gegevens zullen ook vergeleken worden eerdere
transcriptome sets in met groei factor gestimuleerde T98G cellen.
e: HAT functie: Momenteel wordt getest welke technieken het beste functioneren
om dit in CREBBP te testen: een filter gebonden assay dat de overgang van
radiogelabeled acetaat van acetyl CoA tot eiwit meet, of spectroscopische
eiwit-gekoppelde assays die de HAT reactie naar verkleining van NAD+ door
pyruvaat of alpha-ketoglutarate dehydroxygenase meet. Beide technieken hebben
speciale eigenschappen en in een momenteel lopende voor-studie wordt bepaalt
wat de beste methode is voor het huidige doel.
f: TGF-beta signalering zal worden bestudeerd in gekweekte cellen en ingevroren
biopten door analyze van nucleaire localisatie van het P-SMAD2 door immuno
fluorisering in cellen of door immunohistochemie. Ook expressie levels van TGF
beta, TFGBR (Alk5), P-Smad2 en expressie van SMAD2 target genen (fibronectine,
collageen type I, plasminogeen activator inhibitor 1 en matrix
metalloproteinase 2) zullen worden bestudeerd door Western blotting en /of
quantitatieve PCR.

Belasting:
De patient en begeleider wordt gevraagd om 3 gevalideerde vragenlijsten in te
vullen. Er zal een lichamelijk onderzoek plaatsvinden, de POSAS (litteken
score) wordt afgenomen en het keloid/ de keloiden zal/zullen gemeten en
gefotografeerd worden. Bloedonderzoek (10cc veneus bloed) geschiedt ter
bepaling van jeukparameters.
Van 5 patienten zullen een 3 tal 2 mm biopten worden afgenomen. Dit is van
gezonde huid, de grens huid-keloid en het midden van het keloid. De plek van
biopsie zal vantevoren met patient en ouder besproken worden. Alle biopten
zullen worden afgenomen als de patient onder algehele anaesthesie is om andere
redenen.

Risico's:
De biopsiewond die genomen wordt van normale huid heeft een kleine kans om zich
tot een keloid te ontwikkelen, aangezien we dit biopt nemen van een plek op het
lichaam waar zich normaal gesproken geen keloid vormt( het been). Het biopt uit
het midden van het keloid zal het keloid ook niet vergroten. Alleen het biopt
dat genomen wordt op de rand keloid - gewone huid heeft een kans om tot
verergering van het keloid te leiden. Dit biopt is essentieel voor het
onderzoek.