Liquid biopsie in prostaatkanker

Prostaatkanker is in Europa bij mannen de meest voorkomende vorm van kanker, en
de derde belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerd overlijden bij mannen.
Het grootste deel van gemetastaseerde prostaattumoren zijn hormoongevoelig en
reageren in eerste instantie goed op androgene therapie, uiteraard via de
androgeenreceptor (AR) die aanwezig is op de prostaattumorcel. Progressie naar
een gemetastaseerd hormoon-ongevoelige (castraat-resistente) vorm van
prostaatkanker (mCRPC) is echter veelal onvermijdelijk. Een van de oorzaken
hiervan is een mutatie in de AR. De meestvoorkomende mutatie betreft een
splice-variant van de AR, genaamd AR-V7. Voor de behandeling van mCRPC zijn
recentelijk een aantal nieuwe geneesmiddelen op de markt gekomen. Uit
moleculair-biologische studies blijkt dat een groot gedeelte van patienten met
een mCRPC klinisch interessante mutaties hebben in het DNA dat codeert voor
sleutelenzymen in de signaalroute dat geactiveerd wordt door de
androgeenreceptor (AR). Een veelbelovende nieuwe behandelingsoptie in mCRPC is
het induceren van apoptose door het behandelen van daarvoor gevoelige tumoren
met zogenaamde poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) remmers. Het blijkt namelijk
dat ca. 20% van de mCRPC-patienten een mutatie hebben in een van de hiervoor
verantwoordelijke DNA-repair-genen. Daarnaast worden ongeveer 3% van de mCRPC
aangedreven door microsatellite instability (MSI). Pembrolizumab is recentelijk
door de FDA vrijgegeven als medicijn voor de behandeling van tumoren gebaseerd
op MSI-fenotype, ongeacht het tumortype.

Binnen de medische oncologie wordt *personalised medicine* steeds belangrijker.
Hiervoor speurt men naar de aanwezigheid van specifieke mutaties waarvoor men
gebruik kan maken van doelgerichte therapie. Deze mutaties kunnen opgespoord
worden door óf specifiek te zoeken naar deze mutaties middels PCR, óf door
*next generation sequencing (NGS)* op het tumormateriaal. Met NGS kan het hele
genoom in beeld worden gebracht. De procedure is kostbaar en zeer arbeid- en
kennisintensief. NGS heeft de voorkeur binnen de wetenschap aangezien hierdoor
nieuwe targets en nog onbekende resistentie-mechanismen kunnen worden
opgespoord. Binnen de klinische praktijk is er echter behoefte aan een
betrouwbare, snelle en goedkope test van reeds vastgestelde en bekende
mutaties. Inmiddels is bekend, dat mutaties tijdens behandeling van tumoren
over de tijd veranderen. Hierdoor is er noodzaak tot herhaalde biopsie ontstaan
teneinde de juiste patiënten te kunnen selecteren voor effectieve maar soms
toxische en kostbare behandelingen. Verder is er nog de bekende
tumorheterogeniteit, waardoor sommige mutaties kunnen worden gemist.

De *liquid biopsy* is een techniek waarbij celvrij DNA (cfDNA) wordt geïsoleerd
uit het bloedplasma. In bloedplasma is cfDNA aanwezig afkomstig van zowel
gezonde cellen als van tumorcellen (ctDNA). Er blijkt een grote overeenkomst te
zijn tussen mutaties aanwezig in de primaire tumor en mutaties gevonden in
cfDNA. Soms werden er meer mutaties vastgesteld bij *liquid biopsy* dan bij de
weefselbiopsie. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat de gevonden mutaties
bij *liquid biopsy* een betere weerspiegeling geeft van alle aanwezige
metastasen in het lichaam.
De *liquid biopsy* is een innovatie die waarschijnlijk binnen afzienbare tijd
en op grote schaal in de dagelijkse oncologische praktijk ingezet gaat worden.
Voor de test is hooguit een buisje bloed nodig. Inmiddels zijn er ook *liquid
biopsy* procedures in ontwikkeling op andere lichaamsvochten zoals urine, maar
ook semen, BAL-vloeistof, pleura- of ascitesvocht. Hierdoor zal de inzet van
deze techniek verder toenemen. De toepassing van deze techniek is niet alleen
beperkt tot de keuze van de juiste behandeling voor een patiënt. Als gevolg van
het toepassingsgemak is *liquid biopsy* met analyse van ctDNA in de toekomst
ook bruikbaar voor diagnosestelling, vroege opsporing van kanker, evaluatie van
ingezette behandeling en voor het tijdig monitoren van mogelijke
resistentie-ontwikkeling. Gezien de hoge toekomstverwachting van deze techniek
is het van belang om tot de ontwikkeling te komen van een snelle, betrouwbare
en goedkope methode om deze techniek in te zetten in de dagelijkse praktijk.
Binnen de longoncologie zijn er grootschalige initiatieven opgezet en
geëvalueerd die de toepasbaarheid van deze techniek in de dagelijkse praktijk
ondersteunen. Ook bij andere oncologische aandoeningen is de verwachting dat
ctDNA een vaste plaats bij diagnostiek, behandeling en follow-up gaat krijgen.

Doelstelling:
Doel van dit project is de ontwikkeling van een eenvoudige, werkbare ctDNA
analyse met klinisch relevante moleculaire markerpanels die m.b.v. PCR ingezet
kunnen worden in het zorgpad van de patiënt met een prostaatcarcinoom
(t.b.v.diagnostiek, monitoring therapie, MRD-detectie etc).

De vraagstelling is tweeledig:
1. Het ontwikkelen van een betrouwbare, reproduceerbare en logistiek eenvoudige
procedure om ctDNA uit bloed, maar ook uit urine (volledig noninvasief) te
isoleren
2. Het ontwikkelen van een moleculair panel die ingezet kan worden bij zowel de
screening, de monitoring als ook de MRD-detectie van prostaattumoren. Bij
prostaatcarcinoom maar ook bij blaas-, ovarium-, en mammacarcinoom kunnen
veranderingen in DNA *repair* genen aangrijpingspunten bieden voor therapie.
Binnen het zorgverbeterplan zal de doelgerichte moleculaire analyse in eerste
instantie dan ook gericht worden op DNA *repair* mutaties. Daarnaast zal er
binnen Zuyderland ook nog specifiek gekeken worden naar het oppikken van de
AR-V7 mutatie, zowel in bloed als in urine.

Ad. 1 Isolatie van cf-T-DNA uit bloed en urine
Het cf-T-DNA bestaat uit kleine DNA-fragmenten (100-180 basenparen) die
vrijkomen bij necrose en apoptose van (tumor)cellen. Deze zijn uiterst
kwetsbaar en een goed ingerichte pre-analyse van deze monsters is uiterst
cruciaal. Tot op heden is hier weinig onderzoek naar gedaan en is er geen
eenduidige evidence wat de best practice is. In het pre-analytisch proces
kunnen diverse aspecten onderscheiden worden:
1. Type afnamebuis/opvangsysteem
2. Transport van afname-punt naar lab
3. Omgevingscondities tot verwerking (omgevingstemperatuur)
4. Tijd tot verwerking
5. Verwerking o.a. centrifugatie, DNA-isolatie kit
6. Opslag van het geïsoleerde cf-T-DNA

Ad. 2 Ontwikkelen moleculair panel
Na het onderzoeken van de best practice procedure zoals beschreven in Ad. 1 zal
in dit deel van het onderzoek de procedure zoals vastgesteld gevolgd worden
waarbij geselecteerde moleculaire markers in bloed en urine samples van mCRPC
patiënten bepaald worden. Voor de validatie zal gebruik worden gemaakt van
reeds bestaande databank St Radboud ziekenhuis Nijmegen. Hierover wordt reeds
overleg gevoerd. Zuyderland Medisch Centrum heeft de beschikking over het Roche
Cobas z480 systeem ten behoeve van de liquid biopsy. Met dit systeem kan via
RT-PCR door gebruik te maken van Taqman probes circulerend cf-T-DNA
geanalyseerd worden. In dit deel van het onderzoek zal m.b.v. de Cobas z480
(Roche) een panel aan geschikte mutaties onderzocht worden. Met het design van
het panel wordt gebruik gemaakt van online search-functionaliteiten (bv naar de
20 meest voorkomende mutaties in prostaatcarcinoom volgens de COSMIC database
(cancer.sanger.ac.uk/cosmic)) en uitgebreide literatuurstudie. Daarbij zullen
mutaties bekeken en geselecteerd worden met een therapeutisch aangrijpingspunt
(bv die ingrijpen op PARP-inhibitoren). Ook wordt er specifiek gekeken naar
het opzetten van een test voor het detecteren van de AR-V7 mutatie, zowel in
bloed als in urine.

Mbv bovengenoemde literatuursearch en ontwerp van het panel, zullen de
geschikte primers en probes uitgetest worden. Hierbij zal de focus op
technische haalbaarheid, gevoeligheid (limit of detection) en specificiteit
(geen valspositieven) liggen. Hiervoor zal met name gebruik worden gemaakt van
cellijnen, commerciële controlemonsters en restmateriaal van
routine-diagnostiek. Het uiteindelijke samengestelde en geteste panel zal
vervolgens in een geselecteerde patiëntenpopulatie getoetst worden, voor en
tijdens therapie.

Gezien de aard en werkwijze van het onderzoek, is niet te verwachten dat er een
serieuze additionele risico voor de gezondheid van de patienten te verwachten
is. De belasting betreft enkele minuutjes extra bij de reeds geplande
poli-bloedafname voor het aankomende poli-bezoek bij de medisch oncoloog (2
extra bloedbuizen en een urineportie).