studie naar de rol van subcutaan en visceraal vetweefsel in het mechanisme van obesitas geinduceerde insuline resistentie

Het stijgende aantal patiënten met overgewicht vormt een gezondheidsprobleem op
korte en lange termijn. Overgewicht gaat gepaard met een toegenomen risico op
onder andere: diabetes mellitus, hartvaatziekten en subfertiliteit. Dit valt
voor een groot deel te verklaren door de aan obesitas gerelateerde
hyperinsulinaemie, hyperandrogenaemie en dyslipidaemie. Niet alleen de
hoeveelheid lichaamsvet maar vooral de verdeling daarvan lijkt genoemde
factoren negatief te beïnvloeden Het is aangetoond dat de metabole activiteit
van het viscerale vetweefsel zich van het metabolisme in het subcutaan
vetweefsel onderscheidt. Beide soorten vetweefsel scheiden eiwitten
(adipokinen) uit welke betrokken zijn bij de regulatie van het
energiemetabolisme in het lichaam, o.a. de regulatie van voedselopname en
insuline gevoeligheid. Dit maakt vetweefsel een belangrijk targetorgaan bij het
ophelderen van het mechanisme van obesitas-gerelateerde insuline resistentie,
het voorstadium van type 2 diabetes. De darm beïnvloed de adipokine productie
d.m.v. peptide hormonen zoals GIP en GLP-1 waarvan is aangetoond dat ze invloed
hebben op de insuline gevoeligheid, mogelijk doormiddel van veranderingen in de
adipokine spiegels in het bloed. Ook korte keten vetzuren, gevormd door
fermentatie processen in het colon, kunnen de adipokine uitscheiding
beïnvloeden. Een belangrijke hypothese voor het ontstaan van insuline
resistentie gaat er van uit dat obesitas leidt tot een chronische ontsteking
van het vetweefsel welke leidt tot oxidatieve stress en tot veranderingen in de
productie van adipokinen met als gevolg insuline resistentie in perifere
weefsels zoals spier en lever. Behalve adipokinen kunnen ook de recent ontdekte
exosomen een rol spelen bij de inductie van insuline resistentie. Exosomen zijn
membraan vesicles die geproduceerd kunnen worden door o.a adipocyten. Bij
immuuncellen is aangetoond dat exosomen behalve eiwitten ook RNA kunnen
bevatten welke de genexpressie door andere cel typen kan beïnvloeden. De
mogelijkheid bestaat dat, naast adipokinen, exosomen, geproduceerd door
vetweefsel, op deze manier de insuline gevoeligheid van perifere weefsels
kunnen beïnvloeden. Deze onderwerpen zullen worden onderzocht in deze
exploratieve studie. In een pilot studie is inmiddels de kweektechniek van de
humane vetbiopten gevalideerd en beschreven door de onderzoeksgroep. Ook is
m.b.v proteomics technologie het secretome (de verzameling van uitgescheiden
eiwitten) van het viscerale vetweefsel gekarakteriseerd en gepubliceerd.


Het onderzoek valt binnen het onderzoek van het *Nederlands proteomics
platform*, het Top Instituut Pharma* en het speerpunt *Chronisch Zieken* van
het UMCG.

Het hoofddoel van de studie is het ophelderen van het mechanisme van
obesitas-gerelateerde insuline resistentie. Hiertoe zal de relatie bestudeerd
worden tussen de verschillende cel typen in visceraal en subcutaan vetweefsel
en hoe dit het adipokine profiel beïnvloed. Met name de interacties tussen
macrophagen en adipocyten zullen worden bestudeerd. Hierbij wordt ook gekeken
naar de rol van exosomen. Verder zal worden gekeken naar de interacties tussen
darmfactoren, zoals de darmhormonen GIP en GLP-1 en korte keten vetzuren, en
subcutaan en visceraal vetweefsel.
Om de effecten van de bovengenoemde factoren op het vetweefsel te kunnen
vergelijken zal een kwantitatieve proteomics aanpak ontwikkeld worden welke
gebruikt maakt van stabiel isotoop gelabelde aminozuren die, ingebouwd in
eiwitten, het mogelijk maken om m.b.v. massaspectrometrie verschillen in
eiwitexpressie te kunnen kwantificeren.
Om de eiwitten die gevonden zijn m.b.v. de proteomics analyse in vitro te
valideren in vivo zullen deze gecorreleerd worden aan de
lichaamsvetdistributie, gemeten d.m.v waist-hip ratio en BMI,. en serumspiegels
van deze factoren.

exploratieve studie naar de basale mechanismen van insuline resistentie waarbij
gebruik wordt gemaakt van vetbiopten verkregen uit subcutaan en visceraal
vetweefsel van patienten die een laparotomie ondergaan wegens gynaecologische
aandoeningen.
Materiaal en Methode
Op de operatiedag zal tijdens algehele anesthesie, een nuchter bloedmonster
worden afgenomen ten tijden van de narcose. Serum zal worden ingevroren in -80
°C . Een vetbiopt (2-5g) worden genomen van subcutaan (t.h.v. de incisie van de
operatiewond) en visceraal vet (omentum). Deze biopten worden in buizen met 200
ml PBS (phosphate buffered saline) + 5mM glucose + 50 µg/ml gentamycine, naar
het laboratorium vervoerd. Het weefsel wordt gewogen en in gelijke hoeveelheden
verdeeld over petri schalen voor weefselkweek. De weefselkweek procedure wordt
uitgevoerd volgens Fried en Moustaid-Moussa10 en is geoptimaliseerd voor
proteomics doeleinden m.b.v. van vetweefsel verkregen van een muismodel voor
diabetes type 2 (leptine deficiente ob/ob muis) en m.b.v. humaan subcutaan en
visceraal vet. De methode is beschreven in de publicaties van de eigen
onderzoeksgroep door Alvarez-Llamas et al.12 en Szalowska et al.13 .M199 medium
+ 50 µg/ml gentamycine + 60 nM insuline wordt toegevoegd in een verhouding van
10 ml/g weefsel. Weefsels worden gedurende 1 tot 3 dagen gekweekt. Daarna wordt
het medium verwijderd en ingevroren (-20 °C en -80°C) voor proteomics analyse.
Analyse van de media zal plaats vinden m.b.v. LC-MS/MS. Deze methode is
beschreven door Alvarez-Llamas et al.12. De eiwitten in de media worden
hiervoor geconcentreerd m.b.v. ultrafiltratie en daarna gefractioneerd op een
SDS-PAGE gel. Het laantje wordt in 30 stukjes gesneden en de eiwitten in de gel
stukjes worden gedigesteerd met trypsine. Het digest wordt vervolgens
gescheiden op een HPLC en geanalyseerd in een massaspectrometer. Dit levert de
eiwitsamenstelling van het kweekmedium op. Het vetweefsel zelf word gebruikt
voor de analyse van adipokine genexpressie m.b.v. RT-PCR en DNA arrays. Ten
behoeve van de serumbepalingen van adipokinen zal gebruik worden gemaakt van
commercieel verkrijgbare multiplex ELISA kits voor de beschreven adipokinen.

De ingreep ten behoeve van het verkrijgen van een subcutaan en visceraal vet
biopt geven geen reële risicotoename voor de patiënten die geopereerd wordt
voor de gynaecologische ingreep. De biopten worden afgenomen t.h.v. de
incisiewond van de ingreep, zijnde de voorste buikwand en het omentum.