Toepassing van fluorescentie bij de diagnose van de actinische keratose en het plaveiselcelcarcinoom van de huid

Eerder werd door ons de potentiële waarde van fluorescentie diagnostiek (FDAP)
als een non-invasieve diagnostische procedure onderzocht om te kijken of we
onderscheid kunnen maken tussen verschillende KIN-stadia bij actinische
keratosen. In dit onderzoek werd FDAP uitgevoerd in patiënten met
field-cancerization na keratolytische voorbehandeling. Vervolgens werden er
biopten genomen van verschillende laesies. Op deze biopten werd
(immuno)histochemie verricht voor nadere histopathologische classificatie, door
middel van de KIN- evenals de conventionele classificatie, het bepalen van de
Ki67 expressie en de dikte van het stratum corneum.
Hoewel KIN III laesies neigden naar een verhoogde laesionale:non-laesionale
fluorescentie ratio vergeleken met KIN I/II laesies, werden er geen
significante verschillen in de macroscopische fluorescentie ratio*s gevonden
tussen de verschillende KIN-stadia. Zes laesies welke werden geclassificeerd
als verruceuze hyperkeratosen hadden een significant lagere fluorescentie
ratio, zo meestal rond de 1, vergeleken met normale huid, KIN I, KIN III en
miSCC laesies. De drie gebiopteerde SCC*s hadden een significant hogere
fluorescentie ratio vergeleken met de KIN II laesies en verruceuze
hyperkeratosen. Analyse van de proliferatie activiteit door middel van
positiviteit voor Ki67-antigen toonde ook geen significante verschillen in de
fluorescentie ratio*s binnen de drie niveaus van Ki67 expressie, wat niet
vreemd is omdat Ki67 expressie en KIN-graad een sterke correlatie hebben.
Echter, wanneer de laesies onderverdeeld in vier diagnostische categorieën
(terecht/fout positief/negatief), met een fluorescentie ratio van 1.0 als
afkappunt en KIN laesies/SCC en verruceuze hyperkeratosen/normale huid
geclassificeerd als (pre)maligne en benigne laesies respectievelijk, werd er
een significant lager aantal Ki67+ cellen gevonden in laesies met een
fluorescentie intensiteit lager dan omliggende huid (fluorescentie ratio < 1.0;
terecht- en fout-negatieven) vergeleken met laesies met een fluorescentie
intensiteit hoger dan omliggende huid (fluorescentie ratio > 1.0; terecht- en
foutpositieven). Wanneer Ki67 expressie binnen de vier diagnostische
categorieën onderling werd vergeleken, werd er een significant verschil
gevonden tussen de fout- en terecht-positieve laesies en tussen de
terecht-positieve en -negatieve laesies. De reden hiervoor zou mogelijk kunnen
zijn gelegen in het relatief hoge aantal terecht-positieve laesies die vaak
hyperproliferatief zijn. Dus, proliferatie activiteit lijkt eerder een
confounder te zijn dan de oorzaak van een hoge fluorescentie intensiteit.
Wanneer macroscopische fluorescentie waarden werden uitgezet tegen de stratum
corneum dikte, werd er een negatieve correlatie gevonden wat impliceert dat
hyperkeratose een belemmerende factor is met betrekking tot PpIX accumulatie.
Naar analogie hiervan werd er een dikker stratum corneum gevonden in laesies
met een fluorescentie intensiteit lager dan omliggende huid (fluorescentie
ratio < 1.0; terecht- en fout-negatieven) vergeleken met laesies met een
fluorescentie ratio hoger dan 1.0 (terecht- en foutpositieven). Bovendien werd
er in de terecht- en foutpositieve laesies een significant dunner stratum
corneum gevonden dan in de foutnegatieve laesies.
Uit het bovenstaande wordt geconcludeerd dat FDAP niet gebruikt kan worden om
onderscheid te maken tussen verschillende KIN-stadia. Echter, er werd een
tendens gezien naar een hogere macroscopische fluorescentie intensiteit in KIN
III laesies ten opzichte van KIN I/II laesies. Dit kan te maken hebben met een
verhoogd aantal epidermale cellen in KIN III laesies (epidermale hyperplasie).
Hoewel er een tendens was naar een dikker stratum corneum in KIN III laesies
vergeleken met KIN I/II laesies, konden geen statistisch significante
verschillen worden aangetoond. Men kan zich voorstellen dat een dikker stratum
corneum in KIN III laesies het fluorescentie contrast zou kunnen verminderen
tussen de KIN I/II en KIN III laesies. De macroscopische fluorescentie bleek
onafhankelijk te zijn van de proliferatie graad. Gezien de hoge fluorescentie
intensiteit die werd gezien in miSCC, is het aangewezen verdere studies te doen
om te zien of FDAP zou kunnen worden gebruikt om KIN laesies te onderscheiden
van invasief plaveiselcelcarcinoom.

Doel van het onderzoek is om na te gaan of met behulp van fluorescentie
diagnostiek non-invasief actinische keratosen kunnen worden onderscheiden van
plaveiselcelcarcinomen.

Materiaal en methoden
Fluorescentie diagnose en biopsie procedure

Voor dit onderzoek worden maximaal 20 patiënten met zowel actinische keratosen
als plaveiselcelcarcinomen van de huid geincludeerd, waarschijnlijk minder.
Gedurende 1 week voor de FDAP wordt de huid door patiënt voorbehandeld met 5 of
10% salicylzuur in Vaseline.
Op de dag van de FDAP procedure wordt, evt. na curettage, 20% ALA-creme (Medac
Gmbh, Wedel; Germany) of Metvix geappliceerd en afgedekt met een occlusief
verband. Na 3 uur wordt de crème verwijderd en wordt de fluorescentie
intensiteit op de huid gemeten, gebruik makend van een digitaal fluorescentie
imaging systeem (DyaDerm, Biocam GmbH, Regensburg; Germany). Dit systeem
bestaat uit een flitslamp en een 12-bit Sony CCD camera. Deze zijn gekoppeld
aan een Pentium IV computer die voorzien is van beeldvormende software (Dyaderm
Pro v1.4, Biocam GmbH, Regensburg; Duitsland).
Na de FDAP, worden, na locale verdoving, maximaal 4, 4 mm, pons biopten van de
geselecteerde tumoren genomen.

Analyse van fluorescentie beelden
16-bit grijsschalen TIFF fluorescentie beelden worden geïmporteerd in NIH
ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Omdat de Xenon lichtbron die
gebruikt wordt voor de excitatie de hoogste intensiteit in het centrum van het
belichte veld heeft, wordt er en schaduw correctie uitgevoerd volgens het
volgend algoritme:
Met
B = wit beeld (beeld van de witte homogene achtergrond), BImax = hoogste
intensiteit van het witte beeld, I = (niet gecorrigeerd) beeld, C = normalised
shading image, S = shading corrected image.

Histopathologie en immunohistochemie
De biopten zullen worden beoordeeld door de patholoog (W. Blokx). De ki-67
kleuring zal worden gescoord en bij actinische keratosen zal de KIN
classificatie worden beoordeeld.

Immunohistochemische en digitale beeld analyse
Ki67-expressie wordt semikwantitatief gescoord (Keating et al.13) : 0 = only
basal layer positivity, 1 = positivity confined to basal 1/3 of the epidermis,
2 = positivity confined to basal 2/3 of the epidermis, 3 = transepidermal
positive staining.
Analyse van de digitale microscopische beelden wordt verricht met behulp van
ImageJ digital image analysis software. Digitale foto*s van de HE-coupes zullen
worden gemaakt met een 50x vergroting. De gemiddelde dikte van het stratum
corneum zal worden bepaald door de dikte van het totale stratum corneum
inclusief de hyperkeratose per millimeter lengte van het stratum corneum in de
verschillende coupes te beoordelen.

Statistische analyse
Voor de Ki67-expressie en de KIN-graad in relatie tot fluorescentie intensiteit
wordt de one-way analysis of variance (ANOVA) gebruikt. Voor analyse tussen de
verschillende groepen wordt de Duncan*s post-hoc test gebruikt. De ongepaarde
Student*s t-test wordt gebruikt voor analyse van de fluorescentie intensiteit,
de Ki67-expressie en de dikte van het stratum corneum tussen de verschillende
diagnostische categorieën. Tevens zal een correlatie analyse van de
macroscopische fluorescentie en de dikte van het stratum corneum worden
berekend met behulp van de Pearson*s R. Alle statistische berekeningen worden
uitgevoerd met Statistica 6.0 software (Statsoft Inc., http://www.statsoft.com)
en Microsoft Excel 2000. Een p-waarde < 0.05 wordt beschouwd als statistisch
significant.

De patienten zullen ongeveer 5 uur op de afdeling aanwezig zijn. Eerst zal de
creme worden aangebracht en afgedekt, waarna patient gedurende 3 uur moet
wachten op onze dagbehandelingsafdeling. de creme wordt dan verwijderd en de
huid wordt belicht met Woodslicht. Daarna zullen maximaal 4 biopten van 4 mm
van de verschillende plekken worden genomen na lokale verdoving. Bij deze
patienten is een deel van de procedure standaard. De applicatie van de creme,
het wachten en de belichting met Woodslicht is de extra belasting.