Bepaling van eiwitprofielen in glasvocht bij acute post-operatieve endophthalmitis met behulp van Surface Enhanced Laser desorption/ionization time-of-flight (SELDI-tof) technologie.

Endophthalmitis is een oog-ontsteking, die primair in het glasvocht en het
voorste oogkamer vocht voorkomt. De patiënt ervaart frequent hevige pijn in
combinatie met forse roodheid van het oog. De ontsteking wordt gediagnosticeerd
met biomicroscopie. Een infectie wordt aangetoond met een reguliere kweek,
afkomstig van een glasvochtbiopt. Endophthalmitis wordt behandeld met
intravitreaal antibiotica, initieel met breedspectrum antibiotica. Op basis van
de uitslag van de kweek kan de behandeling aangepast worden aan het
micro-organisme dat gedetecteerd is in het glasvochtbiopt. In het geval van
endophthalmitis welke binnen 6 weken na cataractextractie ontwikkelt, wordt bij
ongeveer 70% een verwekker van de infectie aangetoond. Echter tot wel 30% van
de kweken blijft negatief.(1) Tot op heden is niet aangetoond of er bij
negatieve kweken sprake is van een steriele ontsteking of dat de bacteriële
load in het glasvochtbiopt te laag is om met kweek aan te tonen. Bijkomend
nadeel van de reguliere kweektechnieken is dat de uitslagen enkele dagen op
zich laten wachten. Met nieuwe technieken zou de diagnostiek rond
endophthalmitis geoptimaliseerd kunnen worden.

SELDI-tof is een techniek waarmee met behulp van biomarkers detectie eiwitten,
van de patiënt of van pathogenen, in vloeistoffen kunnen worden aangetoond.
Deze techniek is reeds effectief gebleken bij detectie van verwekkers van
diverse infecties, waaronder intra-amnion infecties, SARS en congenitaal CMV
hepatitis.(2,3,4) Het eiwitprofiel blijkt in hoge mate sensitief en specifiek
voor diverse bacteriële en virale verwekkers. Deze techniek kan worden
toegepast op diverse lichaamsvochten en is uitermate geschikt voor
microvolumina. Slechts 1 microliter is nodig om op een biochip aan te brengen.
De eiwitten binden vervolgens aan deze chip en worden in het SELDI-tof apparaat
door een laser geïoniseerd en losgeschoten in een vacuüm buis. De snelheid
waarmee deze eiwitten door deze buis migreren is een maat voor de massa van het
eiwit. Dit resulteert in een piekenpatroon specifiek voor het diverse
eiwitstructuren. Ontstekings-specifieke biomarkers of verwekker-specifieke
biomarkers kunnen worden geïdentificeerd door de profielen van patiënten
onderling en met die van controles te vergelijken.
Tot heden zijn er geen gegevens bekend over contaminatie van glasvocht met
serumeiwitten bij perforatie van de bulbus tijdens een operatie of afname van
een biopt. Tevens wordt theoretisch diffusie van ontstekingseiwitten vanuit de
bloedbaan naar het glasvocht mogelijk geacht.



Referenties:

1. Results of the Endophthalmitis Vitrectomy Study. A randomized trial of
immediate vitrectomy and of intravenous antibiotics for the treatment of
postoperative bacterial endophthalmitis. Endophthalmitis Vitrectomy Study
Group. Arch Ophthalmol 1995;113:1479-96.
2. Gravett MG, Novy MJ, Rosenfeld RG, et al. Diagnosis of intra-amniotic
infection
by proteomic profiling and identification of novel
biomarkers.
JAMA 2004;292:462-9.
3. Kang X, Xu Y, Wu X, et al. Proteomic fingerprints for potential application
to early
diagnosis of severe acute respiratory syndrome. Clin Chem
2005;51:56-64.
4. Ward DG, Suggett N, Cheng Y, et al. Identification of serum biomarkers for
colon
cancer by proteomic analysis. Br J Cancer 2006;%19;94:1898-905.

Het evalueren van de bruikbaarheid van het SELDI-tof technologie bij het
vaststellen van ziekte-specifieke eiwitprofielen van bacteriële verwekkers in
glasvochten van patiënten met endophthalmitis na cataractextractie. Er wordt
bepaald of deze eiwitprofielen aangetoond kunnen worden bij glasvocht monsters
van patiënten met endophthalmitis met een negatieve kweek uitslag.


Primaire doel:
Het evalueren van de bruikbaarheid van het SELDI-tof technologie in
vergelijking tot reguliere kweekmethodes bij het vaststellen van
ziekte-specifieke eiwitprofielen van de volgende species:
-bacteriële verwekkers in glasvochten van patiënten met endophthalmitis
ontstaan na cataractextractie.

Secundair doel:
Indien de kweek van glasvocht bij endphthalmitis geen bacteriele groei vertoont:
-analyse met SELDI-tof van het eiwit-patroon van glasvocht met een
negatieve kweek vergelijken met eiwitpatronen
van glasvocht van endophthalmitis waarbij de verwekker bij kweek is
geidentificeerd. Evaluatie naar overeenkomsten in
de eiwitpatronen tussen deze beide groepen.

To evaluate the usefulness of SELDI-tof (surface enhanced laser desorption/
ionisation-technology) technology in determination of disease-specific protein
profiles of bacteria in vitreous of patients with endophthalmitis after
cataract surgery.
Protein profiles of vitreous samples from endophthalmitis patients with a
negative culture will be compared to those from patients in which the bacterial
cause is identified.

De controle groep bestaat uit twee subgroepen: 30 patiënten die aan een
maculagat worden geopereerd en 30 patiënten die aan een macula pucker worden
geopereerd. De operatie vindt op voorkeur van de patiënt onder retrobulbair
verdoving of algehele anesthesie plaats. Bij beide subgroepen dient tijdens de
operatie, een pars plana vitrectomie, het glasvocht te worden geaspireerd
vanwege de chirurgische behandeling van de macula. Het glasvocht wordt hierbij
weggegooid. Voor deze studie zal na toestemming van de patiënt aan het begin
van de operatie 0,2 ml onverdund glasvocht worden afgenomen en worden
opgeslagen bij
-80 graden Celsius op de afdeling Virologie. Voor aankomst op de afdeling
Virologie zal het glasvocht worden gecodeerd. Patiënten met retinopathie ten
gevolge van diabetes mellitus of uveitis in het verleden worden geëxcludeerd.
Tevens zal bij 10 patiënten, na verlenen van informed consent, een stolbuis
bloed worden afgenomen. Van dit bloed wordt het serum gescheiden en opgeslagen
bij -80 graden Celsius. Ook het serum worden gecodeerd voor aankomst op de
afdeling Virologie.

De groep patiënten met endophthalmitis bestaat uit patiënten die
endophthalmitis hebben ontwikkeld binnen 6 weken na een cataractextractie.
Patiënten met uveitis in het verleden in het aangedane oog zullen worden
geëxcludeerd. Bij deze populatie wordt onder retrobulbair anesthesie een
glasvochtbiopt (0,2-0,3ml) gedaan met behulp van een vitrectoom. Tevens wordt
na afname van het biopt breedspectrum antibiotica in de glasvocht ruimte
geïnjecteerd. Het biopt van het glasvocht wordt op kweek gezet. Voor dit
onderzoek zal na toestemming van de patiënt van het glasvochtbiopt 0,1 ml
worden gesepareerd en worden opgeslagen bij -80 gr Celsius. Tevens zal bij 10
patiënten, na verlenen van informed consent, een stolbuis bloed worden
afgenomen. Van dit bloed wordt het serum gescheiden en opgeslagen bij -80
graden Celsius. Zowel het glasvocht en serum zal worden gecodeerd voor
aankomst op de afdeling Virologie.



Analyse:

Het SELDI-tof apparaat bevindt zich op de afdeling Virologie van het UMC
Utrecht.
Slechts een zeer kleine hoeveelheid oogvocht en serum worden gespot op een NP
20 biochip, een array die frequent voorkomende eiwitten bindt, en aan de lucht
gedroogd. Vervolgens wordt met het SELDI-tof apparaat de mate van migratie van
het eiwit gerelateerd aan het moleculair gewicht van het eiwit. Het gewicht
van de diverse eiwitten in een glasvochtbiopt tonen diverse pieken in een
golfpatroon.
Met behulp van de SELDI-tof Biomarker Analysis Module, Expression Difference
Mapping (EDM) analyse en de Cluster Wizard (Ciphergen Express Software 3.0)
wordt statistische analyse toegepast op de experimenten. Met EDM worden
multipele experimenten statistisch geanalyseerd op eventuele biomarkers en met
behulp van de Cluster Wizard kunnen pieken geclusterd worden (een cluster is
een groep pieken met dezelfde massa, op dezelfde soort array). Statistische
significantie wordt bereikt bij P < 0.05.

De volgende analyses worden uitgevoerd:
1. Onderscheid in eiwit samenstelling van glasvocht in vergelijking tot het
serum verkregen bij maculagat
of macula pucker operaties: beide subgroepen van de
controle-populatie
2. Onderscheid in eiwit samenstelling van glasvocht in vergelijking tot het
serum van patiënten met endophthalmitis
3. Onderscheid in eiwit samenstelling van glasvocht van endophthalmitis
patiënten versus de controle populatie
4. Evaluatie van relatie van specifieke verwekkers van endophthalmitis
aangetoond via kweek met specifieke
piekpatronen verkregen via SELDI-tof analyse.
5. Evaluatie van samenhang tussen glasvocht van endophthalmitis met een
negatieve kweek uitslag en het piek
patroon verkregen bij SELDI-tof analyse. Vergelijking van deze
patronen met de patronen van specifieke
verwekkers aangetoond met kweek zal plaats vinden.

Per subgroep zal bij 10 patiënten zowel glasvocht als bloed worden afgenomen.
Deze patiënten zullen mondeling en schriftelijk over het onderzoek worden
geïnformeerd
(zie: informatiebrief deelname studie endophthalmitis/ maculagat of pucker). De
stolbuis bloed zal worden afgenomen, indien de patiënt informed consent heeft
gegeven. Indien de patient deelname aan de studie weigert, zal wanneer de
patient ook afname van glasvocht voor de studie weigert (mondelinge
toestemming: er wordt een aantekening in de poliklinische status gemaakt), geen
glasvocht worden afgenomen tbv van de studie. Wanneer de patient zowel afname
van glasvocht als serum weigert, zullen deze beiden niet worden verzameld tbv
de studie.

De patiënten zullen geen hinder ondervinden van de afname van maximaal 0,1ml
glasvocht, aangezien zowel bij de controle populatie als de populatie met
endophthalmitis minstens 0,2 ml glasvocht wordt afgenomen voor kweek. De
minimum vereiste voor een kweek van afname van glasvocht bij endophthalmitis
bedraagt 0,1 ml. Concluderend dient er geen additionele hoeveelheid glasvocht
te worden afgenomen.


English version:

The collection of blood samples will only take place after permission of the
patient through signing informed consent.
Patients will not experience any additional discomfort, because of all 3
patient groups a minimum of 0.2 ml vitreous for culture or more (in case of
pars plana vitrectomy) is extracted for therapeutic purposes. The minimum
required amount of vitreous for culture is 0.1 ml. Consequently, no extra
vitreous needs to be collected for this study. Both samples of vitreous and
serum will be coded before arrival on the department of Virology to protect
patients privacy.