De rol van intestinale permeabiliteit en inflammatie in de pathogenese van insuline resistentie en niet alcoholische steatohepatitis bij morbide obesitas.

De incidentie van obesitas, niet-alcoholische vetleverziekte (NAFLD) en
insuline resistentie (IR)/diabetes mellitus type II (DMII) stijgt sterk.
Obesitas, NAFLD en IR/DMII zijn nauw met elkaar verbonden. Mensen met obesitas
hebben een 5-40 maal hogere kans op DMII, en een ongeveer 20 keer zo hoog
risico op NAFLD, afhankelijk van de mate van obesitas. Daarnaast is IR op zich
een belangrijke risicofactor voor NAFLD. NAFLD kan leiden tot een ontsteking
van de lever, en wordt dan niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) genoemd.
Uiteindelijk kan dit proces culmineren in leverfibrose of zelfs cirrhose, met
een grote mortaliteit. Ondanks dat deze leverziekte kan leiden tot leverfalen
en uiteindelijk tot de dood, is er op dit moment nog geen uitwendig
diagnosticum en behoudens gewichtsafname, is er nog geen behandeling voor deze
ziekte. Bariatrische chirurgie geeft echter op termijn wel reductie van de
leverinflammatie.

De laatste jaren is duidelijk geworden dat activatie van het immuunsysteem een
belangrijke causale rol speelt in de ontwikkeling van IR/DMII en NASH.{zie
referenties in het onderzoeksprotocol: Shoelson, 2006 #10}
Zo blijken muizenstammen die deficiënt zijn voor genen betrokken bij de
productie van inflammatoire mediatoren, resistent voor de ontwikkeling van
obesitas-geïnduceerde DMII. Illustratief hiervoor is dat tumor necrosis factor
(TNF)-α knock-out muizen geen obesitas geïnduceerde IR ontwikkelen [3].
Ondanks het feit dat inflammatie een causale rol speelt bij de ontwikkeling van
IR/DMII en NASH, is nog grotendeels onbekend wat de oorzaak is van de
inflammatoire respons. Echter, blootstelling aan bacteriële endotoxinen lijkt
één van de factoren te zijn die een rol spelen bij de ontwikkeling van zowel
NASH als IR/DMII. Zo is al langer bekend dat obese muizen en ratten gemakkelijk
NASH ontwikkelen als reactie op lage doses bacteriële producten
(endotoxinen){Yang, 1997 #43}.
Het feit dat probiotica deze leverinflammatie verminderen{Li, 2003 #41} wijst
er bovendien op dat in dit inflammatoire proces levende bacteriën een rol
spelen. De meest waarschijnlijke bron van bacteriële endotoxinen is de darm.
Inderdaad is bewezen dat muizen op een hoog vet dieet verhoogde endotoxine
niveaus in de poortader hebben{Yoshimatsu, 2004 #44}. Nog recenter is
aangetoond dat obese muizen een verhoogde doorlaatbaarheid van de darm vertonen
die leidt tot verhoogde portale endotoxine niveaus en daarmee activatie van
immuuncellen in de lever{Brun, 2006 #8}. Een extra aanwijzing voor de
betrokkenheid van de darm bij de ontwikkeling van obesitas in mensen is de
invloed van de samenstelling van de darmflora op het lichaamsgewicht.{Ley, 2006
#22} Daarnaast is beschreven dat de samenstelling van de darmflora en de
darmintegriteit anders is bij obese muizen met DMII, en dat de insuline
gevoeligheid bij deze muizen verbetert na antibiotica behandeling (Cani
Diabetes 2007).

Humane data zijn tot op heden nog schaars. Er is een studie gepubliceerd waarin
het endotoxine niveau in plasma van type 2 diabeten 76% hoger bleek te zijn dan
dat van gematchte controles{Creely, 2006 #38}. Het is niet bekend of deze
specifieke patiënten ook NASH hadden, maar dit wordt wel aannemelijk geacht,
aangezien een zeer groot deel van de type 2 diabeten NASH heeft. Echter, de
diagnose NASH kan alleen gesteld worden met een histologisch biopt, wat in deze
populatie niet verricht is. Recenter is beschreven dat bij patiënten met NASH
een hogere doorlaatbaarheid van de darm na toediening van aspirine bestond
vergeleken met controles, en bovendien een hogere endotoxinespiegel wordt
gevonden in NASH (Farhadi A, Gundlapalli S, Shaikh M, et al Liver Int.
Susceptibility to gut leakiness: a possible mechanism for endotoxaemia in
non-alcoholic steatohepatitis.2008 Aug;28(7):1026-33).
Daarnaast is ook beschreven dat al in NAFLD (voorstadium van NASH) patiënten er
hogere plasma endotoxine spiegels en inflammatoire markers meetbaar zijn ten
opzichte van controles (Thuy J Nutr 2008). Het betreft hier studies met kleine
aantallen patiënten. Tot slot zijn recent de eerste resultaten gepubliceerd
waaruit blijkt dat, net als bij muizen, ook bij mensen met overgewicht een
relatief verhoogd percentage bacteriën van de Firmicute klasse wordt gevonden,
dat bovendien weer afneemt na afvallen. {Ley, 2006 #22},{Turnbaugh, 2008 #106}

Samenvattend lijkt het dat obesitas gepaard gaat met een verstoorde darmflora,
een verhoogde doorlaatbaarheid van de darm en verhoogde plasma endotoxine
niveaus, en dat deze endotoxinen via het induceren van inflammatie bijdragen
aan het ontstaan van NASH en insuline resistentie.

Bij individuen met ernstig overgewicht leidt chirurgische interventie
(maagverkleining, gastric bypass, etc.) tot een sterke verlaging van de
incidentie van DMII. Vergelijkbare resultaten zijn beschreven met betrekking
tot de leverziekte NAFLD/NASH (Nonalcoholic fatty liver disease en
non-alcoholic steatohepatitis).
Interessant genoeg dalen parallel hieraan de plasma spiegels van de initieel
verhoogde inflammatoire mediatoren die betrokken zijn bij de pathogenese van
IR/DMII/NASH.
Het is dan ook te verwachten dat ook de doorlaatbaarheid van de darm en de
endotoxine spiegels in het bloed zullen dalen na bariatrische chirurgie.

In dit onderzoek zijn de doelen:

1) Aantonen dat bacteriële translocatie als gevolg van verhoogde intestinale
permeabiliteit bij morbide obesen te opzichte van controles een oorzaak is van
de ontstekingsrespons die leidt tot IR/DMII en NAFLD

2) Aantonen dat verbetering van de intestinale permeabiliteit na
gewichtsverlies door bariatrische chirurgie een mechanisme is dat bijdraagt aan
de verbetering van de inflammatie, insuline sensitiviteit en NAFLD bij morbide
obese individuen.

We gebruiken daarvoor als belangrijke markers darmschade, darmflora,
inflammatie in plasma, vetweefsel en insuline target organen (lever, spier), en
metabole parameters.

De hiervan afgeleide deelvraagstellingen zijn:

1.Is de intestinale permeabiliteit verhoogd bij morbide obese patiënten met
NAFLD of DMII vergeleken met morbide obesen zonder NAFLD of DMII?

2.Is intestinale permeabiliteit gecorreleerd met endotoxine spiegels bij
morbide obese patiënten?

3.Houden de endotoxine spiegels in het bloed verband met inflammatie, insuline
gevoeligheid en NAFLD bij morbide obese patiënten?

4.Is de samenstelling van de darmflora anders bij morbide obese patiënten met
NAFLD of DMII vergeleken met morbide obesen zonder NAFLD of DMII?

5.Leidt gewichtsreductie na bariatrische chirurgie tot een vermindering van de
intestinale permeabiliteit, endotoxine spiegels, inflammatie, insuline
resistentie en NAFLD in morbide obese patiënten?

6.Verandert de samenstelling van de darmflora door gewichtsverlies bij morbide
obese patiënten met NAFLD of DMII?

Op het moment dat de patiënt aangemeld wordt voor de bariatrische operatie,
wordt de patiënt benaderd om mee te doen aan dit onderzoek. Indien de patiënt
mee wil doen en aan de inclusiecriteria voldoet zal een afspraak worden gemaakt
voor verder toelichting en informed consent.
Poliklinisch wordt dan voor de operatie een afspraak gemaakt om een zogenaamde
intestinale permeabiliteitsmeting te doen, waarbij participanten een glas met
opgeloste suikers drinken en we urine verzamelen (gedurende 5 uur).

De patiënt wordt geopereerd volgens de huidige standaarden. Voorafgaand aan de
operatie zal door de patiënt faeces verzameld worden ter evaluatie van de
faecale darmflora. Op de dag van operatie zal 's ochtens routinematig 20 ml
bloed worden afgenomen, waar bovenop 6 ml extra voor het onderzoek, om
relevante parameters te bepalen. De bloedafname vindt plaats op de afdeling,
gelijktijdig met het afnemen van bloed voor routinematig onderzoek in het kader
van de operatie.

Tijdens de operatie zullen biopten van visceraal en subcutaan vet, spier, lever
worden genomen. In het geval van een gastric bypass of een biliopancreatische
diversie wordt ook een darmbiopt afgenomen.

Tijdens de standaard protocollaire follow-up gerelateerd aan de bariatrische
operatie zal na 6 weken, 3 maanden, 6 maanden, 12 maanden en 24 maanden de
patiënt op de polikliniek chirurgie teruggezien worden. Als patiënten meedoen
aan het onderzoek wordt vergeleken met normaal telkens 6 ml extra bloed worden
afgenomen.
12 maanden na de operatie wordt dan bovendien ook een kleine hoeveelheid
subcutaan vet afgenomen en opnieuw een permeabiliteitsmeting verricht
(suikerdrank met bloedafname en urinecollectie). Voor beide
permeabiliteitsmetingen geldt dat voorafgaand aan de meting, de avond van te
voren en de ochtend van test, patiënten 400mg ibuprofen slikken.
Verder zal 12 maanden post-operatief nogmaals aan de patiënt gevraagd worden
faeces te verzamelen.

De opzet van het onderzoek is globaal weergegeven in figuur 1 in het
onderzoeksprotocol.

Risico in verband met de testsubstantie

De saccharideoplossing is samengesteld uit door de Europese Unie goedgekeurde
voedingsstoffen. Van deze stoffen die eerder gebruikt werden voor
onderzoeksdoeleinden zijn in deze hoeveelheden geen onbedoelde of ongunstige
(bij-)werkingen beschreven. In deze studie wordt zeer weinig van de genoemde
stoffen gebruikt. Het te verwachten risico van deze testoplossing is zodoende
zeer gering.

De NSAID die toegediend wordt (ibuprofen, 2x400mg) is een gangbaar medicijn
hetgeen vaak door deze onderzoekspopulatie (zowel morbide obesen als de
controlepopulatie) gebruikt wordt voor pijn- en of gewrichtsklachten.

Zij zijn in Nederland vrij verkrijgbaar en worden onder meer gebruikt bij
tandextracties, gewrichtsklachten, jicht, reuma, niet-bacteriële ontstekingen,
pijn, oedeem, stollingsindicaties en dysmenorroe. In de praktijk worden NSAIDS
ook vaak gebruikt bij hoofdpijn.

De bijwerkingen van NSAID*s zijn over het algemeen mild, beschreven zijn met
name maag-darmstoornissen, meest voorkomend zijn misselijkheid, anorexie,
braken, buikpijn, diarree, obstipatie, ulcus in geval van chronisch gebruikt.
Centrale effecten zoals migraine-achtige hoofdpijn, duizeligheid, licht gevoel
in het hoofd, vermoeidheid (malaise en lusteloosheid), verwardheid en oorzuizen
(tinnitus) kunnen optreden. Uitzonderlijk vindt een allergische reactie plaats
zoals huidreacties (uitslag, zwelling, jeuk). Echter in deze doseringen zijn
dergelijke bijwerkingen niet te verwachten. Het verwachte risico is daarom zeer
gering. Bovendien wordt vanzelfsprekend per participant nauwkeurig uitgevraagd
of men dit type medicijn al eerder heeft geslikt en wat de ervaringen waren.

Risico in verband met procedures die ondergaan worden:

De afname van bloed zal verricht worden door de ervaren onderzoeker door middel
van venapunctie in een armvene. Het aanprikken van een ader kan gevoelig zijn.
Het risico van deze ingreep is laag en het wordt routinematig in dit ziekenhuis
uitgevoerd. Het mogelijke risico is het ontstaan van een blauwe plek ter
plaatse van de insteekplaats van de naald bij bloedafname. Deze zal in enkele
dagen spontaan verdwijnen.

Het afnemen van subcutaan vet wordt uitgevoerd door een ervaren arts. Indien
nodig kan deze plaatsvinden onder supervisie van dr. Bouvy, chirurg in het AzM.
Bij deze ingreep wordt de patiënt eenmaal geprikt voor het aanleggen van een
lokale verdoving, vervolgens is de procedure niet meer pijnlijk voor de
proefpersoon. De locatie van verdoving en incisie is dezelfde als de tijdens
de operatie gebruikte incisie voor het plaatsen van de camera. Er worden
zodoende geen extra littekens gemaakt. Omdat maximaal 100 mg weefsel wordt
verwijderd bestaat er geen risico op blijvende cosmetische schade door afname
van het vetbiopt. Mogelijke risico*s zijn het ontstaan van een hematoom of een
ontsteking ter plaatse van de incisie. Proefpersonen worden verzocht contact op
te nemen met de onderzoeker in geval van het optreden van problemen. De
onderzoeker zal adequaat handelen in geval van het optreden van een ontsteking.
Zo nodig wordt er overleg gepleegd met de aanwezige chirurg.

De afname van de lever- vet- en darmbiopten gaat niet gepaard met ongerief voor
de patiënt aangezien dit onder algehele anaesthesie tijdens de
maagverkleinings-operatie door de chirurg wordt gedaan. Een mogelijke
complicatie is een nabloeding op de plek van afname. In de lopende studie **Rol
van vetweefsel residente macrofagen in de pathogenese van insuline resistentie
bij morbide obese patiënten* (MEC 04-141 in Maastricht) zijn inmiddels bij ruim
130 proefpersonen op dezelfde wijze biopten genomen. Bij geen van deze
proefpersonen zijn er complicaties opgetreden door afname van de biopten. In
een onderzoek waarbij op vergelijkbare wijze bij 515 morbide obese personen
tijdens een maagverkleiningsoperatie dezelfde typen biopten werden afgenomen,
werd geen enkele maal een complicatie gerapporteerd39. Wij verwachten dan ook
geen complicaties in de huidige studie. Mocht desondanks een nabloeding
optreden, dan zal deze direct door de chirurg behandeld worden. Gezien het
geringe risico op complicaties door het afnemen van de biopten en de unieke
kans om hierdoor informatie te kunnen krijgen over de inflammatoire status van
de insuline target organen en de functionele integriteit van de darm achten wij
het afnemen van de biopten gerechtvaardigd.