Pilot-studie naar de farmacokinetiek van p-fenyleendiamine en zijn metabolieten na applicatie op de huid door middel van Raman spectroscopie.

Met een toenemend aantal vrouwen, maar ook mannen en steeds jongere kinderen
die hun haar verven, stijgt de prevalentie van sensibilisatie en daarmee
contactallergie voor p-fenyleendiamine (PPD).[1,2] Alhoewel de exacte
prevalentie niet bekend is, wordt in grote onderzoekscohorten de sensibilisatie
voor PPD in de algemene bevolking geschat op 0,1 tot 2,3%.[3] Een minder vaak
voorkomende, maar andere manier om voor PPD gesensibiliseerd te raken is het
laten zetten van een tijdelijke hennatatoeage, contact met zwarte
rubbermaterialen, of zelfs het gebruik van mascara waaraan PPD is
toegevoegd.[2,4,5] Sensibilisatie komt ook voor in het kader van
kruisreactiviteit met azo-kleurstoffen in kleding.[5-7] Een contact allergische
reactie op PPD kan zeer heftige verlopen, zich uitend in roodheid, zwelling,
blaren en korsten. In ernstige gevallen kan dit zelfs leiden tot een
ziekenhuisopname.

Contactallergie is een overgevoeligheidreactie van het vertraagde type, op
kleinmoleculaire stoffen (haptenen). Ondanks de vele jaren bestaande herkenning
van allergie voor PPD, is het immunologische mechanisme achter de
sensibilisatie nog altijd niet compleet opgehelderd.[8,9] Er is b.v. geen
humane in vivo farmacokinetische data (distributie, metabolisme, excretie) over
PPD, na applicatie op de huid.
Vanuit in vitro experimenten is bekend dat PPD in een waterige omgeving en in
contact met de huid gevoelig is voor sequentiële oxidatie en zelfconjugatie,
resulterend in vorming van onstabiele, intermediaire producten zoals
benzoquinonediimine, benzoquinone en het stabiele product Bandrowski*s
Base.[17-19] Een aantal van deze stoffen kan als mogelijk hapteen worden
beschouwd [18] Er bestaat echter veel discussie over welk hapteen
verantwoordelijk is in de sensibilisatie voor PPD. Daarnaast hebben
verschillende onderzoeken aangetoond dat de humane huid (N-acetyltransferase 1)
enzymen bevat die PPD acetyleren tot mono-acetyl PPD (MAPPD) en di-acetyl PPD
(DAPPD) en dat deze acetylatie wordt gezien als detoxificate-proces omdat MAPPD
en DAPPD een verminderd tot afwezig potentieel hebben tot sensibilisatie. [20]

Er bestaan verschillende methodes om inzicht te verkrijgen in dermale absorptie
en kinetiek van een chemische stof. De meest relevante methode is een humane in
vivo absorptiemeting, zoals in experimentele blootstellingstudies bij
vrijwilligers. Logischerwijs zijn dit veelal invasieve experimenten, welke
strak gereguleerd en beperkt mogelijk zijn. Naast de daarom ontwikkelde in
vitro methodes, bestaan er een aantal minder invasieve in vivo methodes, zoals
plasma- en excretiemetingen, microdialyse en *tapestripping*.[10] Elk van deze
methodes heeft echter zijn specifieke beperkingen (b.v.. destructiviteit,
gebrek aan accuratesse en/of ruimtelijke resolutie). Een geheel andere in vivo
methode, de spectroscopie, biedt daarentegen een aantal voordelen; het is snel,
niet-invasief en kan *real-time* gegevens verschaffen over penetratie van de
chemische stof door de huid. In tegenstelling tot de Infrarood Spectroscopie
(IS) welke alleen de buitenste laag van het stratum corneum bereikt, is de
Confocale Raman Spectroscopie (CRS) geschikt om informatie te verkrijgen van de
moleculaire huidstructuur tot de diepte van enkele honderden micrometers onder
het huidoppervlak.[11]
Door middel van dit in vivo, non-invasieve onderzoek naar de farmacokinetiek
van PPD na applicatie op de humane huid, trachten wij inzicht te verkrijgen in
en bij te dragen aan onderzoek naar etiologie van contactsensibilisatie voor
PPD. Een beter inzicht zal in de toekomst mogelijk kunnen leiden tot het
definiëren van personen met een verhoogd risico op en de vermindering, danwel
vermijding van sensibilisatie voor PPD.

Confocale Raman Spectroscopie (CRM) is een elegante, non-invasieve methode
welke gedetailleerde informatie over de molecuaire structuur en samenstelling
van de huid te verschaft.[21] Ook maakt CRM het mogelijk moleculaire
veranderingen in de huid na applicatie van topicale medicamenten te volgen.[21]
In CRM wordt het monster verlicht door monochromatisch laserlicht. Dit licht
reageert met de moleculen in het monster, welke dan in staat zijn intern te
vibreren of te roteren om verschillende assen. Interactie tussen moleculen en
het licht waarmee het wordt beschenen ('incident' licht), leidt tot verstrooing
van dit licht. Het grootste deel van het verstrooide licht wordt gevonden een
golflengte gelijk aan dan dat van het 'incident' licht (elastisch- of
Rayleigh-verstrooing genoemd). Een klein van het verstrooide licht wordt echter
gevonden op golflengtes langer dan dat van het 'incident' licht en wordt
inelastische- of Raman-verstrooing genoemd. Dit verstrooide licht bevat
frequentieverschuivingen ten opzichte van het 'incident' licht, welke
geassocieerd zijn met moleculaire vibraties binnen het molecuul. Elke
frequentieverschuiving, welke kan worden opgenomen en vertaald door een optisch
dispersief systeem naar een zogenaamd Raman- spectrum, is afhankelijk van
atoommassa, chemische verbindingen en moleculaire structuur en interacties en
is daarom zeer molecuulspeciefiek. Daarom representeert een Raman-spectrum een
vingerafdruk of 'fingerprint' waardoor een molecuul kan worden geïdentificeerd.
[22] Door het vergelijken van spectra van 'blanco' huid (zonder PPD) met
spectra van huid na topicale applicatie, kan PPD in de huid worden
gedetecteerd. De diepte waarop PPD zich in de huid bevindt, kan worden bepaald
m.b.v zogenaamde waterprofielen. Deze profielen correleren een van nature in
humane huid aanwezige watergradiënt, aan de diepte van de huid.[22]

Door middel van dit in vivo onderzoek trachten wij op een non-invasieve manier
inzicht te verkrijgen in de farmacokinetiek van PPD geappliceerd op de humane
huid. Door inzichten te verkrijgen in penetratiesnelheid, penetratiediepte,
verdeling over de verschillende huidcomponenten (stratum corneum, epidermis,
dermis) en metabolisering (omzetten van PPD in de trimeer Bandrowski's Base
en/of de detoxificatieproducten mono-acetyl PPD en di-acetyl PPD) wordt
getracht de immunologische weg van PPD te doorgronden.

Als we door middel van dit pilot-onderzoek inzicht verkrijgen in de
farmacokinetiek van PPD in de humane huid bij vrijwilligers, kunnen we in de
toekomst mogelijke verschillen detecteren tussen farmacokinetiek in gezonde
vrijwilligers en de farmacokinetiek bij PPD gesensibiliseerde patiënten.
Uiteindelijk zou dit kunnen bijdragen tot het definiëren van personen met een
verhoogd risico en de vermindering, danwel vermijding van sensibilisatie voor
PPD.

Voorts bestaan er verschillende concepten voor het mechanisme van T-cel
activatie door PPD. Het hapteen-eiwit concept stelt dat PPD een pro-hapteen
vertegenwoordigt welke na penetratie door de huid wordt gemodificeerd, om
vervolgens door antigeenpresenterende cellen te worden aangeboden aan naïeve
T-cellen.[17] Een ander concept stelt dat PPD rechtstreeks, middels een
reversibele, niet covalente binding aan een MHC-klasse-II-molecuul (*major
histocompatibility complex*), zonder verdere modificatie, in staat is de
proliferatie van T-cellen te stimuleren.[18] Dit PPD-eiwit complex lijkt een
additioneel antigeensignaal voor T-cellen van allergische patiënten te
vertegenwoordigen. Geavanceerde technieken in de Raman microscopie kunnen het
mogelijk maken om binding van moleculen aan reeds in de huid aanwezige eiwitten
zichtbaar te maken. Dit is een mogelijk vervolgexperiment voor de toekomst.

Experiment 1: penetratie en klaring van PPD
a: Stratum corneum (SC) penetratie als functie van applicatieduur en
klaringstijd
b: Diepere penetratie (epidermis (ED)/dermis) als functie van applicatieduur en
klaringstijd

Product: 1% PPD in vaseline
Applicatie: bedekt middels een 'Finn-chamber' (pleister waarin op een
vierkantje de te testen stof is aangebracht)
Plaats: volaire zijde onderarm (3 plaatsen per onderarm, gebruik linker en
rechter onderarm)
Vrijwilligers: 6 (om voldoende betrouwbare metingen te verkrijgen)
Benodigd: meting van SC dikte (zgn. waterprofiel; nodig ter relatie van de PPD
penetratie om zo de diepte te kunnen bepalen)
meting PPD profiel ('fingerprint profile') over de gehele
SC dikte

Experiment 1a:
Meetduren:
Voor elke plek is zowel een waterprofiel (SC dikte) benodigd, als een PPD
profiel. Vanwege biologische variatie, worden er 10 metingen herhaald per
meetplek.
Waterprofielen worden gemeten -4 tot 40 micrometer in 4 micrometer stapjes in
1s/frame (+/- 24s/profiel)
Fingerprintprofielen kunnen worden gemeten in 0 tot 24 micrometer in 2
micrometer stapjes in 6s/frame (+/- 91s/profiel)
Totale tijdsduur voor 10 herhalingen (inclusief overhead tijd): 26 min.

Tijdsschema:
Gebaseerd op een totale tijdsduur van iets onder de 30 minuten per meetplek, is
er een scenario opgesteld om zo goed en efficiënt mogelijk alle tijdstippen te
kunnen meten. (Gebaseerd op een exploratief experiment, is het niet te
verwachten dat er nog veel PPD te detecteren is na 6 uren of later. Indien
noodzakelijk kan worden geverifieerd of PPD nog steeds detecteerbaar is 6 uren
na een 30min. applicatie. Als dit zo is, kunnen de experimenten worden
uitgebreid.)

Metingen
Applicatie tijd T = 0 T = 1 hr T = 2 hrs T= 4 hrs T= 6 hrs T = 12 hrs T = 24 hrs
5 min. X X X X
30 min. X X X X
2 hrs. X X X X X X X
48 hrs. X

Met bovenstaand schema, kan een volledige serie worden gemeten in 3 dagen, voor
2 vrijwilligers. Dit zal 3 keer moeten worden herhaald om een meer betrouwbaar
aantal proefpersonen te testen (totaal 6).
Experiment 1b:
Gebaseerd op een exploratief experiment wordt er een kleine hoeveelheid PPD
verwacht in de levende epidermis na 2uren - of langere- applicatie. Om de
diepte van penetratie, dieper dan he SC, te bepalen, wordt de
signaalcollectietijd aanzienlijk langer dan in experiment 1a.
Dus, deze pentratie zal eerst d.m.v. verkennende experimenten moeten worden
bepaald; wat gedaan kan worden in een halve meetdag.

Verkennend experiment 1b:
Tijdsduur: 0,5 dag.
Vrijwilligers: 2
Na 48 uur applicatie (dan wordt de diepste penetratie verkregen; dit is tevens
de applicatieduur die gebruikt wordt bij een diagnostische plakproef)
- bepaling waterprofielen (ter bepaling SC dikte)
- meting van diepe fingerprint profielen van PPD (0-40 micrometer en dieper, in
4 micrometer stapjes) met lange meettijd van 20s per punt, resulterend in ~3,5
min. per profiel.
- De metingen worden maar een aantal keren herhaald, omdat afhankelijk van deze
uitkomsten een gedetailleerd experiment kan worden opgezet.

Experiment 2: Bepalen van de vorming van MAPPD, DAPPD, BB.

- Eerst moeten Raman spectra (fingerprint profielen) van MAPPD, DAPPD en BB
worden bepaald.
- Deze experimenten vereisen een hoge kwaliteitsspectra (= lange meetduur) om
te metabolisatie-producten te kunnen bepalen.
- Verkennende experimenten zijn nodig om te bepalen of MAPPD, DAPPD en/of BB
überhaupt te detecteren zijn en hoelang de meetduur moet zijn om de
hoeveelheden voldoende te kunnen kwantificeren.

De belasting voor de proefpersonen in dit pilot-onderzoek zal bestaan uit:

- Voorafgaand aan deelname: anamnestisch uitsluiten van allergie voor PPD,
actieve huidziekte onderarmen en mogelijk zwangerschap, d.m.v. vragenlijst
meegestuurd met informatiebrief. Tevens anamnese tijdens een eerste afspraak
(30 min.) en inspectie van de onderarmen naar evt. actieve huidziekte en uitleg
zelf bereiden en aanbrengen PPD pleister.

- Drie achtereenvolgende meetdagen, volgens een zo optimaal mogelijk schema.
Dag 1 gedurende 6,5uur, dag 2 gedurende 5,5uur en dag 3 gedurende 4,5 uur
(inclusief pauzes).
- De metingen vinden plaats in het Erasmus Medisch Centrum te Rotterdam.
- De daadwerkelijke belasting bestaat uit het appliceren van een aantal
'patchtests' (pleister met daarin 1%PPD in vaseline) gedurende respectievelijk
5min, 30 min, 2uur en 48 uur. Na verwijdering van de patchtest wordt de huid
schoongemaakt dmv een tissue, waarna de CRM meting kan beginnen.
- Voor 1 meting (applicatie 2uur, meting T=12), zal de patchtest thuis geplakt
en verwijderd moeten worden door de preofpersoon zelf. De proefpersonen zullen
duidelijk worden geïnstrueerd.
- Ten tijde van het dragen van de 48uurs patchtest, wordt de proefpersoon
verzocht de onderarm droog te houden.
- Tijdens de meting legt de proefpersoon de arm op een 'glasplaatje' en rust
daarbij met de elleboog en hand op speciaal uitgeruste steunen. Tijdens de 10
herhaalde metingen van elk ong. 90 seconden, wordt de proefpersoon verzocht
zijn/haar arm zo stil mogelijk te houden. Tussen de metingen kan de
proefpersoon ontspannen en zij/haar arm bewegen. De metingen zijn pijn- en
risicoloos.
- Voor verkennend experiment 1b zullen op de onderzoeker en de spectroscopist
metingen wordden uitgevoerd na 48uurs applicatie. Tijdsduur: 0,5 dag.
- Voor verkennend experiment 2 zal bij het verkrijgen van spectra van de PPD
-metabolieten getracht worden deze metabolieten in de huid terug te vinden na
applicatie van de PPD patchtest. Proefpersoon: onderzoeker. Tijdsduur: 0,5 dag.

De risico's:
- Enige irritatie en jeuk ter plekke van de patchtest. Ter minimalisering van
deze klachten worden hypoallergene pleisters gebruikt. Eventuele irriatie/jeuk
verdwijnt spontaan na het verwijderen van de patch en is te vergelijken met
jeuk bij dragen van een normale pleister.
- Uiterst klein risico (<= 0,3 %, in 10-jaars review) op actieve sensibilisatie
voor PPD. Anamnestisch gaan wij ervan uit dat de participerende proefpersonen
geen allergie voor PPD hebben. Dit kan betekenen dat ze nooit eerder zijn
blootgesteld aan PPD en daardoor nooit gesensibiliseerd hebben kunnen worden óf
dat ze wel zijn blootgesteld (zeer waarschijnlijk, b.v. door kleurstoffen in
kleding), maar tolerant zijn voor PPD en dus geen allergie ontwikkelen.

De Raman Spectroscopie is een unieke methode om humaan, in vivo de
farmokinetiek van PPD te bestuderen, zonder invasieve metingen.[21] Kennis
omtrent de penetratie, distributie en metabolisatie van PPD is noodzakelijk om
het tot nu toe onbekende mechanisme van sensibilisatie te ontrafelen. Wanneer
meer bekend is over de manier waarop de sensibilisatie plaatsvindt, kan
mogelijk op het gebied van preventie, alsook op het gebied van behandeling
worden ingesprongen. Dit zou in de toekomst kunnen bijdragen aan een verlaging
van de prevalentie van allergisch contacteczeem voor PPD in de algemene
bevolking kunnen. In het licht van deze belangen, achten wij de kleine, te
verwaarlozen risico's aanvaardbaar. Bovendien wordt de applicatie van een 1%
PPD plakproef, benodigd voor dit onderzoek, ook in het kader van alledaagse
diagnostiek naar sensibilisatie toegepast op een groot aantal patïenten van de
dermatologie.[12] PPD is opgenomen in de Europese Standaardreeks (een reeks van
verschillende, veel voorkomende contactallergenen) welke is samengesteld na
uitgebreide consideratie en herhaaldelijke evaluatie, door de European Society
of Contact Dermatitis.[13] Een allergeen wordt in zodanige concentratie getest
dat een zo hoog mogelijk aantal gensensibiliseerde personen wordt gedetecteerd,
maar waarbij de kans op actieve sensibilisatie zo laag mogelijk is.[14]
Wetenschappelijk studies tonen aan dat het patch testen met PPD op individuen
die nog niet gesensibiliseerd zijn, of met maar een eenmalige postieve reactie,
geen actieve sensibilisatie veroorzaken en uitgevoerd kunnen worden met
minimaal risico.[14,15] Bovendien, is de dosis waaraan de proefpersonen worden
blootgesteld (in zowel reguliere patchtest als deze pilot-studie), vele malen
lager dan b.v. in het gebruik van haarverf.[16]

Dit pilot-onderzoek heeft als doel een beeld te krijgen van de farmacokinetiek
van PPD in de huid. M.b.v. deze 6 proefpersonen kan een duidelijk beeld
verkregen worden. Daaruit kan voor de toekomst een protocol (optimale
applicatieduur en follow-up metingen) worden afgeleid voor b.v. het testen van
meer gezonde vrijwilligers en/of patiënten, welke dan veel minder
tijdsintensief zal zijn.