Bepaling van de dihydropyrimidine dehydrogenase en thymidylaat synthase activiteit in humane perifere mononucleaire bloedcellen in gezonde vrijwilligers.

5-Fluorouracil (5-FU) en capecitabine, de orale prodrug van 5-FU, zijn
veelvuldig gebruikte antikankermiddelen die gebruikt worden bij onder andere
borst en colorectaal kanker. De actieve metaboliet van 5-FU is 5-fluoro-2*-
deoxyuridine monofosfaat (FdUMP) dat uiteindelijk de DNA synthyse remt. Voor
een groot deel wordt 5-FU echter omgezet naar de inactieve metaboliet
5,6-dihydro-5-fluorouracil (FUH2) door het enzym dihydropyrimidine
dehydrogenase (DPD). Mensen met een (partiele) DPD-deficientie hebben een
vergrote kans op ernstige, potentieel fatale fluoropyrimidine-geinduceerde
toxiciteit bij standaard behandeling met capecitabine of 5-FU. deze
DPD-deficientie komt bij ongeveer 3-5% van de populatie voor, die deels kan
worden verklaard door mutaties in het DPD-coderende gen.

Het enzym thymidylaat synthase (TS) is één van de belangrijkste 'doelwitten'
van chemotherapie met fluoropyrimidines, zoals 5-FU. De actieve metaboliet
5-fluoro-2-deoxyuridine-5-monofosfaat (5-FdUMP) remt TS, dat normaal gesproken
deoxyuridinemonofosfaat (dUMP) omzet in deoxythymidinemonofosfaat (dTMP).
Vervolgens wordt dTMP gefosforyleerd tot deoxythumidinetrifosfaat (dTTP) wat
gebruikt wordt in DNA synthese en reparatie. Met andere woorden, FdUMP remt TS
en daarbij de de novo thymidinesynthese. Remming van thymidinesynthese
blokkeert de synthese van DNA, waardoor het cytotoxische effect van
fluoropyrimidinen tot stand komt. Er zijn aanwijzingen dat TS activiteit kan
dienen als voorspeller voor 5-FU chemotherapie. In verschillende studies is
gevonden dat een hoge TS enzymactiviteit of hoge expressie van het TS eiwit
geassocieerd is met resistentie tegen 5-FU. Bovendien hebben andere studies een
significante verbetering in overleving aangetoond bij patiënten met een lage TS
activiteit in tumorweefsel.1

Naast mutaties die tot een DPD-deficientie kunnen leiden, zijn er ook andere
mogelijke (onbekende) oorzaken. Met een DPD enzym-activiteitsassay zouden
overige DPD-deficiencties geidentificeerd kunnen worden; er is reeds een
verschillend aantal assays beschreven in de literatuur. Voorbeelden hiervan
zijn: 5-FU plasma klaring na een gereduceerde test dosis, [2-C13] uracil adem
test, en DPD activiteitsmeting in witte bloedcellen met behulp van HPLC
gekoppeld aan UV, massa spectrometrische of radioactiveits detectie.
Eerder gedane studies met betrekking tot TS enzymactiviteit zijn vooral
uitgevoerd bij chirurgisch verkregen weefsel. Deze studies hebben een
significant verschil aangetoond in TS activiteit tussen tumorweefsel en normaal
omliggend weefsel. Helaas is een correlatie tussen TS activiteit in PBMCs en TS
activiteit in weefsel nog niet aangetoond. Noch is aangetoond dat de TS
activiteit verschilt in PBMCs afkomstig van kankerpatiënten wanneer ze worden
vergeleken met PBMCs van gezonde personen.

Deze testen worden tegenwoordig echter niet routinematig gebruikt in de
praktijk, omwille van verschillende redenen. Naast het feit dat er op dit
moment geen doseringsrichtlijnen zijn voor poor, intermediate and extensive
5-FU metabolizers, duren de DPD-fenotyperingstesten vrij lang, zijn de niet
altijd patient-vriendelijk en aan de prijzige kant.
De TS enzymactiviteittest is recent ontwikkeld en is nog niet eerder uitgevoerd
in gezonde vrijwilligers of patiënten. Net als bij de DPD test zijn snelle,
goedkope, niet-invasieve en patiëntvriendelijke bepalingen schaars. Sterker
nog, het is onbekend of de TS activiteit in PBMCs en tumorweefsel correleren.
Bovendien is de klinische vertaalslag van TS activiteit naar dosis- of
regimeaanpassingen nog niet gemaakt.

Door de methode die we ontwikkeld hebben kan er nu snel en gevoelig de DPD
activiteit in witte bloedcellen bepaald worden middels HPLC met on-line
radioactiviteits-detectie. Om inzicht te krijgen in de DPD en TS enzym
activiteit in de normale populatie gemeten middels onze methoden, willen we
graag de DPD en TS enzym activiteit in 20 gezonde vrijwilligers meten. Ook
wordt de uracil/dihydrouracil ratio in plasma bepaald om de relatie met DPD en
TS enzym activiteit te bepalen. Daarnaast willen we de DPD gen expressie meten
en gemeten polymorfismsen in DPYD en TYMS correleren aan DPD resp. TS
enzymactiviteit. Om meer inzicht te krijgen in het circadiane ritme willen we
op 7 tijdspunten binnen 24 uur de DPD activiteit meten in eenzelfde persoon.

Primair doel:
• Om de spreiding en de gemiddelde DPD en TS enzym activiteit in witte
bloedcellen van 20 gezonde vrijwilligers te bepalen

Secundaire doelen:
• Om het circadiane ritme van DPD en TS te bepalen in witte bloedcellen
• Om de DPD en TS genexpressie in witte bloedcellen te correleren aan DPD en TS
enzymactiviteit.
• Om gemeten polymorfismen in DPYD en TYMS te correleren aan de DPD en TS
enzymactiviteit.

Om de DPD enzym activiteit in gezonde vrijwilligers te bepalen middels onze
methode, worden gezonde vrijwilligers gevraagd voor deelname aan de studie.
geschreven informed consent zal worden gevraagd van alle gezonde vrijwilligers
voorafgaand aan de studieprocudures. van elke vrijwilliger zal 48 ml bloed
worden afgenomen om 9:00 uur ± 30 minuten. 40 ml zal worden gebruikt voor de
DPD en TS enzymactiviteitstest en genexpressie-analyse, 4 ml zal gebruikt voor
uracil/dihydrouracil analys en 4 ml zal worden gebruikt voor de genotypering.
Demografische data (initialen, geboortedatum, geslacht, tijd van opstaan) zal
worden gevraagd bij de bloed afname. Bij 12 vrijwilligers (6 man, 6 vrouw) zal
het circadiane ritme worden bepaald. Bij deze vrijwilligers zullen gedurende 24
uur 7 bloedafnames plaatsvinden op t = 09:00 h, 13:00 h, 17:00 h, 21:00 h,
01:00 h, 05:00 h en 9:00 de volgende dag (allemaal ± 30 minuten). Dit wordt
gedaan middels 1 venapunctie en een venflon. Voor de afnames 's nachts zullen
de patienten worden opgenomen in het Slotervaart Ziekenhuis om het dag/nacht
ritme zo min mogelijk te storen.

Om witte bloedcellen te isoleren wordt 40 ml bloed afgenomen 4 ml voor
uracil/dihydrouracil analyse en 4 ml voor farmacogenetisch onderzoek. Bij 8
proefpersonen gebeurt dit eenmalig en bij 12 vrijwilligers zal 1 x 48 ml en 6 x
44 ml bloed worden afgenomen. Dit gebeurt middels 1 venapunctie en een venflon
. De belasting en risico's van een venapunctie zijn relatief klein met de
mogelijke bijwerkingen: ongemak, zwellen, blauwe plek en zeer zelden een
infectie