Biobanking en identificatie van biomarkers en onderzoek naar het afweersysteem bij multiple sclerose

Biobanking
Een biobank is een collectie van lichaamsvloeistoffen (bloed, hersenvocht),
geisoleerde cellen en/of weefsel afgestaan door gezonde vrijwilligers en/of
patienten met gekoppelde medische informatie, die beschikbaar wordt gemaakt
voor verder biomoleculair en medisch onderzoek. De Nijmegen MS biobank is een
ziekte-georienteerde biobank, aangezien de specimen verzameld zullen worden in
de context van medische diagnose en behandeling. Biobanken vormen een
voorziening voor onderzoekers om hun begrip van complexe ziektebeelden zoals MS
te verhogen, vanwege de grote variatie in verloop, complexiteit en
heterogeniteit. De mogelijkheid om verschillende fasen van de ziekte, en/of
behandelingsvormen te vergelijken op moleculair niveau is behulpzaam bij het
vinden van biomarkers voor de diagnose van een ziekte of de voorspelling van
het verloop ervan.

Biomarker onderzoek
Voor MS is in de vroege fasen moeilijk een diagnose te stellen, aangezien de
kenmerken en symptomen van MS sterk kunnen lijken op die van andere
aandoeningen, en er een combinatie van klinisch onderzoek en MRI nodig is om de
diagnose te kunnen stellen. Er is dringend behoefte aan een minimaal invasieve,
zeer gevoelige en specifieke diagnostische en prognostische biomarkers om MS te
kunnen identificeren en volgen. Biomarkers kunnen helpen bij de diagnose van
MS, het voorspellen van het begin van de ziekte, en het selecteren van een
passende behandeling. Biomarker onderzoek zal de volgende benaderingen
omvatten: nucleinezuur analyse, proteomics, en serologische analyses.

Omkering van de pathologische auto-immun respons
Op dit moment is er geen genezing van MS mogelijk. Er zijn alleen alleen
symptoom verminderende immuunsysteem-onderdrukkende medicijnen beschikbaar die
de onvermijdelijke progressie van de ziekte slechts vertragen. Aangezien deze
medicijnen langdurig moeten worden gebruikt om effectief te zijn, kunnen de
neveneffecten zeer ernstig zijn (infecties, kanker). Het doel van dit
deelproject is het onderzoeken van een nieuw concept om de progressie van de
ziekte te stoppen door een therapeutische vaccinatie. Dit stopt de
ziekteveroorzakende pathologische auto-immuun respons door tolerantie op te
wekken voor specifieke auto-antigenen. Op deze manier kan verdere progressie
van de ziekte worden voorkomen. Om dit concept te onderzoeken, zijn cellen en
serum nodig om vast te stellen of ex-vivo dendritische cellen en pathologische
autospecifieke T-cellen gestimuleerd kunnen worden met dit therapeutische
vaccin met als doel tolerantiemechanismen op de wekken, zodat tolerantie voor
het auto-antigeen wordt opgewekt. Dit concept therapeutische vaccin kan leiden
tot een genezende behandeling voor zowel MS als andere auto-immuniteitsziekten.

De doelstellingen van dit initiatief zijn:
1. Opzetten van de ziekte-georienteerde biobank: verwerking en opslag van
bloed en hersenvocht specimen en gezondheidsinformatie van MS patienten
(waaronder kunnen vallen: patientengegevens, familiegeschiedenis, levensstijl
en genetische informatie);
2. Ontwikkelen van een diagnostische test voor vroege fasen van MS gebaseerd op
moleculaire biomarkers (DNA, RNA, proteinen en antilichamen) aanwezig in serum
en hersenvocht;
3. Opzetten van een benadering voor een nieuw therapeutisch vaccin voor de
behandeling van MS gebaseerd op het opwekken van tolerantie voor
auto-antigenen.

Alle patienten die het MC centrum Nijmegen bezoeken en voldoen aan de
inclusie/exclusie criteria worden uitgenodigd om deel te nemen aan het
onderzoek. Voorafgaand aan het verzamelen van gegevens en afnemen van specimen
wordt aan elke patient het Patient Informatie en Toestemmingsformulier. Er zal
ook een oproep voor deelname aan het onderzoek worden geplaatst op de website
van het Radboud MS Centrum Nijmegen. Deelnemers zal gevraagd worden om extra
bloed en/of hersenvocht (indien hersenvocht wordt afgenomen) af te staan (zie
onderzoeksprotocol, tabel 1). Bloed en/of hersenvocht zullen tegelijkertijd
worden afgenomen met de afname voor routine klinisch onderzoek, bij dezelfde
punctie. Het extra bloed en/of hersenvocht zal gebruikt worden voor biobanking
(Dr. B.A. De Jong), voor het onderzoek naar MS biomarkers (Prof. G. Pruijn) en
voor het onderzoek naar een therapeutisch vaccin (Dr.ir. T. Luijkx)

Opzetten biobank
Invasieve standaard procedures zoals venapunctie voor afnemen van bloedspecimen
en in sommige gevallen lumbale punctie voor afnemen van hersenvocht zullen
worden gebruikt. Om serum monsters te verkrijgen zal 20 ml bloed worden
afgenomen in serum gel (bruin, 7.5 ml) buisjes. Voor het verkrijgen van plasma
en bloedcellen zal 10 ml bloed (of 60 ml als de patient deelneemt aan het
immunologisch onderzoek) worden afgenomen in EDTA buisjes. 2 ml bloed zal
worden afgenomen in PAXgene bloed DNA buisjes voor verzamelen van bloed,
stabilisering en isolatie van genomisch DNA. Het afnemen van bloed zal worden
verricht volgens de standaard procedures voor het afnemen van bloedmonsters van
het lokale instituut. Patienten zullen ook gevraagd worden om een vragenlijst
(bijgevoegd) in te vullen m.b.t. gezondheidsinformatie.
Na het afnemen van de specimen, zullen naam en andere identificerende gegevens
van de deelnemers vervangen worden door het Subject Identificatie Nummer (SIN).
Het bloed en hersenvocht zullen ter plekke worden verwerkt, of worden
getransporteerd naar de andere locaties op de Afdeling Biomoleculaire Chemie
(Prof. G. Pruijn) en de Afdeling Medische Immunologie (Dr. T. Luijkx), Radboud
Universiteit (Nijmegen). Bloedmonsters zullen worden verwerkt tot de volgende
componenten voor opslag voor langere tijd: plasma, serum en witte bloedcellen.
Toepasselijke aliquotering van specimen zal worden verricht. Gelabelde
cryovials zullen worden opgeslagen in vriezers bij -80°C. Er zal een effectieve
volgsystematiek worden opgezet om de specimen te volgen van de afnamelokatie
tot de aankomst in opslag. Belangrijke componenten van deze systematiek omvat
unieke specimen identificatoren, toepasselijke specimen labels en
inventarissystemen voor specimen tracking. Elke specimen container zal voorzien
worden van een label dat goed blijft zitten onder alle voorziene
opslagomstandigheden.

Biomarker onderzoek
Preklinische onderzoeksfase: de identificatie van mogelijke biomarkers geschikt
voor diagnostische toepassing. Meerdere technieken zullen worden gebruikt voor
de ontwikkeling van biomarkers. Deze fase zal worden uitgevoerd met een beperkt
aantal serum/CSF monsters (n=20 patienten per groep).
Nucleïnezuur en epigenetische analyse: deze fase omvat onderzoek naar
circulerene miRNA en DNA methylatie patronen in serum/CSF. Gemethyleerd DNA en
een bibliotheek van small RNA zullen worden gegenereerd en gevalideerd met
behulp van high throughput sequencing. Onderscheidende DNA en RNA moleculen op
basis van hun correlatie met verschillende fasen van de ziekte zullen worden
geselecteerd.
Proteomics: analyse van eiwit samenstelling in bloed/CSF zal gebruikt worden
over het verloop van de ziekte met behulp van massa spectrometrie en de
identificatie van mogelijke biomarker kandidaten. Als eerste step zal eiwit
fractionering worden uitgevoerd om zeer overvloedig voorkomende eiwitten te
verwijderen. Massa spectrometrie zal worden uitgevoerd en een lijst van
potentiele eiwit biomarkers zal gegenereerd worden.
Identificatie van MS-geassocieerde antilichaam biomarkers: peptide library
screening. Combinatorische bibliotheken van synthetische peptiden (antigenen)
zullen worden gebruikt om liganden te selecteren die binden aan antilichamen
die frequent voorkomen in bloed/CSF van MS-patienten, maar niet in dat van de
gezonde individuen. Peptide bibliotheken zullen worden gescreend met
gecombineerde immunoglobulines van MS patienten.
Preklinische verificatie: de resultaten van de preklinische screeningsfase
zullen worden getest met voldoende statistische power in een grotere en
goed-gedefinieerde klinische setting met een onafhankelijk prospectief cohort
van patienten (n=35 patienten per groep). Deze fase kan informatie opleveren
die kan worden toegevoegd aan klinische richtlijnen.

Inductie van tolerantie voor auto-antigenen
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) zullen worden geisoleerd uit het
bloed van MS-patienten en de gezonde controlegroep, en worden gecultiveerd met
auto-aintigenen onder vastgestelde condities. Vervolgens zullen metingen worden
verricht op cytokines en andere markers om vast te stellen of bepaalde
pathogenische T cellen kunnen worden gedownreguleerd of worden omgevormd naaar
een regulerend fenotype(Treg). Dit zou een concept bevestigen om een
pathogenische auto-immuun respons om te keren en tolerantie op te wekken voor
auto-antigenen, wat gebruikt kan worden om een genezende behandeling voor
MS-patienten te ontwikkelen.

Risico's en belasting: de risico's zijn verwaarloosbaar en de belasting is
minimaal. De meest voorkomende risico's gerelateerd aan het afnemen van bloed
zijn kortdurende pijn en/of kneuzing. Infecties, bloedingen, bloedstolsels en
flauwvallen zijn mogelijk maar niet waarschijnlijk.

Mogelijke voordelen: er is geen direct voordeel voor de patient. Echter, de
deelname van patienten aan dit onderzoek kan helpen kennis te vergaren en
ontdekkingen te doen die in de toekomst kunnen helpen betere of snellere
diagnioses te stellen, of betere behandelingen mogelijk te maken.