De effecten van BCG-vaccinatie op de aangeboren immuunrespons en op immuunparalyse bij gezonde vrijwilligers. Twee proof-of-principle studies.

Sepsis is een groot medisch probleem met een hoog sterftecijfer. Productie van
pro-inflammatoire mediatoren kan resulteren in hemodynamische instabiliteit,
stollingsafwijkingen en orgaandysfunctie. Eerder onderzochte therapieën voor
sepsis waren gericht op remming van pro-inflammatoire mediatoren. Het grote
merendeel van deze studies hebben geen gunstige effecten van dit soort
therapieën laten zien. Dit zou te wijten kunnen zijn aan het feit dat de
meerderheid van de septische patiënten niet bezwijkt aan de initiële
pro-inflammatoire "hit", maar op een later tijdstip sterven in een ernstige
immunosuppressieve staat. Deze zogenaamde 'immuunparalyse', die patiënten
uiterst gevoelig voor secundaire infecties maakt, is een gevolg van
contra-regulatoire anti-inflammatoire pathways in reactie op de eerste
pro-inflammatoire reactie. Immunoparalyse wordt dan ook steeds meer erkend als
de overheersende immuundisfunctie bij sepsis. Als gevolg daarvan is
reconstitutie van immuuncompetentie een nieuw en veelbelovend therapeutisch
doel om uitkomst in sepsis patiënten te verbeteren.

Bacille Calmette - Guerin ( BCG ) is een van de meest toegediende vaccins
wereldwijd . Naast de bescherming tegen tuberculose zijn er aanwijzingen dat
vaccinatie met BCG een aantal extra gunstige niet-specifieke immunologische
effecten heeft. De onderliggende immunologische mechanismen zijn niet volledig
opgehelderd. Recent werd aangetoond dat monocyten functioneel kunnen worden
geherprogrammeerd door vaccinatie met BCG. Productie van pro-inflammatoire
cytokinen door monocyten geïsoleerd uit vrijwilligers na BCG-vaccinatie, bleek
te zijn verbeterd bij ex vivo stimulatie met niet verwante pathogenen, zelfs
maanden na BCG-vaccinatie. De waargenomen effecten met betrekking tot de
modulatie van het aangeboren immuunsysteem worden 'aangeleerde immuniteit'
genoemd. Na stimulatie met een ziekteverwekker, wordt ook het aangeboren
immuunsysteem voorbereid om sneller en efficiënter te reageren op een
secundaire (en niet-gerelateerde) stimulus, zelfs maanden later.

Rekening houdend met deze versterkende effecten van BCG op de aangeboren
afweer, zou vaccinatie met BCG een mogelijke kandidaat zijn voor de behandeling
van sepsis geïnduceerde immunoparalyse. De effecten van BCG-vaccinatie op de
aangeboren immuunrespons bij de mens zijn echter tot nu toe enkel aangetoond ex
vivo. Het moet nog worden vastgesteld of deze bevindingen kunnen worden
geëxtrapoleerd naar de humane in vivo situatie, omdat uit eerdere data van onze
groep blijkt dat ex vivo metingen de in vivo situatie niet nauwkeurig
weerspiegelen. Het humane endotoxemie model, waarbij gezonde vrijwilligers
lipopolysaccharide (LPS) toegediend krijgen afkomstig van Escherichia coli,
wordt veel gebruik om de effecten van systemische ontsteking bij mensen in vivo
te bestuderen en wordt beschouwd als een veilige en zeer reproduceerbare
methode om de aangeboren immuunrespons onderzoeken. Bovendien leidt LPS
toediening tot een hyporesponsieve toestand bij een tweede LPS toediening. Dit
wordt "endotoxine tolerantie" genoemd, en lijkt sterk op sepsis geïnduceerde
immunoparalyse zodat het derhalve gebruikt kan worden gebruikt als model voor
therapeutische interventies.

Omdat de beoogde doelgroep voor deze nieuwe therapie, sepsis patiënten,
immuungecompromitteerd zijn kan het gebruik van een levend verzwakt vaccin
zoals BCG een potentieel risico van gedissemineerde mycobacteriële infectie met
zich meebrengen. Daarom zullen we-γ bestraalde (geïnactiveerd) BCG vaccin in
deze studie gebruiken. Recente nog ongepubliceerde resultaten van de groep van
Prof Netea laten zien dat γ-bestraalde BCG vaccinatie een vergelijkbaar effect
heeft op het trainen van monocyten als het levende vaccin.

In de huidige studie, willen we door middel 2 experimenten de effecten van BCG
vaccinatie op de aangeboren immuunrespons bij de mens in vivo onderzoeken. In
het eerste experiment willen wij onderzoeken of BCG-vaccinatie de aangeboren
immuunrespons van gezonde vrijwilligers op eenmalige toediening van LPS
beinvloed. In het tweede experiment willen we onderzoeken of BCG-vaccinatie de
tolerante toestand waargenomen bij een tweede LPS toediening kan omkeren. Ons
doel is om uiteindelijk deze resultaten te vertalen naar klinische toepassingen
om bijvoorbeeld patiënten met sepsis geinduceerde immuunparalyse te behandelen.

Primaire doelstelling van het experiment met éénmalige LPS-toediening:
Om de effecten van γ-bestraalde BCG-vaccinatie te bepalen op de immuunrespons
na LPS toediening in vivo bij gezonde vrijwilligers.

Primaire doelstelling van het experiment met herhaalde LPS-toediening:
Om de effecten van-γ bestraald BCG-vaccinatie op endotoxine tolerantie
veroorzaakt door menselijke endotoxinemie te bepalen.

Er zijn 5 secundaire doelstellingen:
1. Om de effecten van γ-bestraalde BCG-vaccinatie op de ex vivo respons van
leukocyten te bepalen op verschillende inflammatoire stimuli.

2. Om de effecten van γ-bestraalde BCG-vaccinatie op het fenotype van
circulerende monocyten (bijv. expressiepatroon van celoppervlakte receptoren
door gebruik van flowcytometrie) te bepalen.

3. Om de effecten van γ-bestraalde BCG-vaccinatie op de inflammatoire cascade
(met behulp van qPCR / microarrays) te bepalen.

4. Om de effecten van γ-bestraalde BCG-vaccinatie op epigenetische
veranderingen, waaronder H3K4 trimethylatie, van circulerende immuuncellen te
bepalen

5. Om de effecten van-γ bestraald BCG-vaccinatie op LPS-geïnduceerde klinische
symptomen (ziekte score) en hemodynamische / temperatuurveranderingen te
bepalen.

1. Eenmalige LPS-toediening
Een gerandomiseerde dubbelblinde placebo-gecontroleerde pilotstudie bij gezonde
vrijwilligers.
In deze pilot-studie, zullen we 20 gezonde vrijwilligers includeren. Op dag 1,
zullen 10 proefpersonen met γ-bestraald BCG gevaccineerd worden, en 10
proefpersonen met placebo. Op dag 6 zullen alle proefpersonen vervolgens LPS
toegediend krijgen.

2. Herhaalde LPS-toediening
Een gerandomiseerde dubbelblinde placebo-gecontroleerde pilotstudie bij gezonde
vrijwilligers. Deze studie zal plaatsvinden nadat studie 1 is volbracht, en de
resultaten terug gekoppeld aan de medisch ethische commissie. In deze
pilot-studie, zullen 16 gezonde vrijwilligers geïncludeerd worden. Alle
proefpersonen zullen op dag 1 LPS toegediend krijgen. Op dag 3 zullen 8
proefpersonen vervolgens gevaccineerd worden met γ bestraald BCG, en 8
proefpersonen met placebo. Op dag 8 zullen vervolgens alle proefpersonen een 2e
LPS toediening krijgen.

Eenmalige LPS toediening: Alle proefpersonen (n=20) zullen dubbel-blind gerandomiseerd worden om of γ- bestraalde BCG-vaccinatie (n=10) of placebo (NaCl 0.9% subcutaan, n=10) op dag 1 te krijgen. Op dag 6 zullen alle proefpersonen vervolgens LPS toegediend krijgen (LPS derived from E coli O:113, 1 ng/kg). Herhaalde LPS toediening: Alle proefpersonen (n=16) zullen dubbel-blind gerandomiseerd worden om of γ- bestraalde BCG-vaccinatie (n=10) of placebo (NaCl 0.9% subcutaan, n=10) op dag 3 te krijgen. Alle proefpersonen (n=16) zullen eerst LPS toegdiend krijgen op dag 1 (LPS derived from E coli O:113, 2 ng/kg). Op dag 8 zullen alle proefpersonen voor een 2e keer LPS toegediend krijgen (LPS derived from E coli O:113, 2 ng/kg).

Bij de screening worden een medisch interview, lichamelijk onderzoek en een ECG
verricht.

BCG is wereldwijd een van de meest toegediende vaccins en word goed verdragen
door gezonde vrijwilligers. Lokale bijwerkingen worden vaak gezien maar zijn
niet ernstig. Om ernstige systemische effecten van het vaccin te voorkomen, ie
gedisseminieerde mycobacteriële infectie, zal een γ-bestraald (geinactiveerd)
BCG substraat gebruikt worden. Seroconversie en dus een positieve mantoux test
wordt beschreven in 41.8% van de BCG-gevaccineerde personen wat in de loop der
jaren afneemt tot 21.2% na 10 jaar. In het geval van seroconversie kan een
mantoux test niet gebruikt worden in de diagnostiek van tuberculose. Andere
diagnostiek zoals Quantiferon of een rontgenfoto van de longen blijft echter
voorhanden.

Toediening van LPS veroorzaakt griep-achtige symptomen gedurende ongeveer 4 tot
6 uur. Gedurende endotoxemia, zullen de gezonde vrijwilligers gemonitord worden
op de "research unit" van de intensive care. Zij zullen een arterieel infuus
krijgen om gemakkelijker te kunnen monitoren en bloed af te nemen. Het
arterieel infuus zal onder locale anesthesie (2% lidocaïne) geplaatst worden.
Een veneus infuus zal ook geplaatst worden om vocht en LPS te kunnen toedienen.
Wereldwijd wordt het humane endotoxinemiemodel gezien als een veilig model, er
zijn nooit lange-termijeffecten gerapporteerd. Lipopolysacharide 2 ng/kg is
de meest gebruikte dosering bij humane toediening, alhoewel hogere doseringen
(bijvoorbeeld 4 ng/kg) ook al zijn toegediend zonder dat er lange termijn
bijwerkingen optraden. In 18 humane endotoxemia studies uitegvoerd in ons
centrum (zie IMPD), hebben wij 2 ng/kg toegediend. In één studie (CMO 2006/166)
hebben we oplopende LPS doseringen in 5 opeenvolgende dagen toegediend (0.2,
0.5, 1, 2, and 2 ng/kg). Omdat wij veronderstellen dat BCG-vaccinatie de
immunrespons op LPS toediening zal versterken, zullen wij in het eerste
experiment met de eenmalige LPS toediening slechts de halve dosering LPS
toedienen. In de tweede studie waarin we de effecten van BCG-vaccinatie op
immuunparalyse willen onderzoeken zullen we de normale dosering van 2 ng/kg
gebruiken aangezien de proefpersonen pas gevaccineerd zullen worden na de
eerste LPS-toediening en de immuunrespons op de de tweede LPS-toediening sterk
onderdrukt is door de door de eerste LPS-toediening veroorzaakte "endotoxine
tolerantie". Wij verwachten dat BCG-vaccinatie de immuunrespons op de tweede
LPS-toediening zal herstellen tot eenzelfde mate als bij de eerste
LPS-toediening maar niet nog heviger aangezien wij in een eerdere studie met
eenzelfde studie opzet (CMO 2011/105) krachtigere immuunstimulerende middelen
werden toegediend (IFN-gamma en GM-CSF) om de endotoxine tolerantie te
herstellen. IFN-γ bleek het beste om endotoxine tolerantie te herstellen maar
versterkte de respons nooit meer dan bij de eerste LPS-toediening.

In het Radboud ziekenhuis hebben meer dan 370 vrijwilligers meer dan 445
LPS-injecties toegediend gekregen. Vandaar dat er in ons centrum voldoende
ervaring is met dit model. Randomisatie zal bovendien gebeuren zodat
gegarandeerd wordt dat er nooit 2 BCG-gevaccineerde proefpersonen tegelijk LPS
toegediend zullen krijgen. Een arts en verpleegkundige zullen continu aanwezig
zijn tijdens de experimenten en de proefpersonen zullen continu gemonitord
worden (hartslag, bloeddruk, saturatie). Er zal in totaal maximaal 600ml bloed
worden afgenomen. Dit is vergelijkbaar met andere studies waarbij nooit
bijwerkingen werden gezien. Proefpersonen hebben geen direct voordeel van
deelname aan de studie. Een proefpersonen vergoeding is voorzien.