Ontwikkelings recapitulatie van spinocerebellair ataxie

Spino-cerebellaire ataxie:
Patiënten met spinocerebellaire ataxie (SCA) ervaren als gevolg van een
progressieve degeneratie van het cerebellum een geleidelijk verlies van fysieke
controle terwijl ze hun mentale capaciteiten behouden. Deze genetische stoornis
heeft 60 varianten waarvan er 12 gediagnosticeerd kunnen worden met een
bloedtest. Aangezien er op het moment nog geen remedie is voor SCA, wordt er
gebruik gemaakt van therapeutische rehabilitatie. Deze therapie heeft als doel
symptomen zoals slechte coördinatie van loop, oog, spraak en hand beweging the
verminderen. Er zijn 29 genmutaties verantwoordelijk voor SCA, deze mutaties
zijn geclassificeerd als autosomaal dominant, autosomaal recessief of
X-gekoppeld. De SCA mutant genen leiden tot neurodegeneratie van voornamelijk
de Purkinje neuronen. De Purkinje neuronen ondergaan tenminste één van de
volgende processen: ijzer stress (Anheim et al. 2012), oxidatieve stress (Guo
et al. 2010), mitochondrische dysfunctie (Rugarli and Langer 2012) of proteïne
aggregatie (Orr 2012). Terwijl de genmutaties van SCA gecategoriseerd zijn, is
er in de pathologie nog steeds onduidelijkheid of de regulatie van
transcriptie, de import van proteïnen naar de nucleus, RNA splicing of
ubiquitinatie, de oorzaken of gevolgen zijn van SCA (Orr 2012). Muismodellen
kunnen de menselijke ziekte niet volledig reproduceren vanwege de relatieve
korte levensduur van muizen, terwijl bij de meeste mensen de ziekte pas na een
aantal decennia in hun leven begint. Een andere factor die overwogen moet
worden is de expressieve van de mutant transgene in alle neuronen, tegenover
specifieke populaties zoals Purkinje neurons die dichter gerelateerd zijn aan
de menselijke ziekte. Wat duidelijk is tot nu toe is dat het niet mogelijk is
geweest om de gehele complexiteit van de menselijke zieke te kopiëren in muizen
(Ingram et al. 2012). Omdat neuronen in kweek een kortere levensspanne hebben
dan de levensduur van een muis, gebruiken we celkweken om de moleculaire en
elektrofysiologische gebeurtenissen die het begin van Ataxie voorafgaan te
identificeren. Zodoende, verwachten we niet de neuro-degeneratie volledig samen
te vatten, maar wel de progressie van de neuropathologie deels the kunnen
beschrijven.

Van Cerebellaire ontwikkeling naar spinocerebellaire ataxi ziektemodellen:
Purkinjecellen van muismodellen van SCA vertonen alteraties in innervatie
(Barnes et al. 2011) en intrinsiek vuurgedrag (Shakkottai et al. 2011). Het is
nog niet duidelijk welk ontwikkelingsstadium leidt tot deze fenotypes en welke
moleculaire gebeurtenissen eraan voorafgaan. Tot nu toe zijn er menselijke IPS
cellen gedifferentieerd in neuronen om de moleculaire gebeurtenissen van Ataxia
Telangectiasia te bestuderen (Carlessi et al. 2013). Ataxia Telangectiasia is
de twee na grootste gemeenschappelijke autosomale recessieve SCA.
Differentiatieprotocollen van menselijke IPS cellen, met en zonder het Ataxia
Telangiectasia gen, hebben gabaergische, glutamatergische (De Filippis et al.
2007) en dopaminergische neuronen Donato et al. 2007) voortgebracht. Op deze
manier kan de moleculaire onset van de ziekte, in vitro, worden onderzocht
(Carlessi et al. 2013).
De huidige uitdaging is echter, om gespecialiseerde neuronen, zoals Purkinje
neuronen, te verkrijgen, omdat met name deze neuronen sensitief zijn voor de
mutant SCA genen.
Onlangs is het gelukt om embrionische stamcellen van muizen te differentiëren
in Purkinje neuronen (Muguruma et al. 2010). Mede door dit succes, zullen we
dit protocol met embrionische stamcellen (Muguruma et al. 2010), waarin de
neuronale differentiatie van menselijke IPS cellen zal plaatsvinden, aannemen.
Dit protocol bestaat uit de volgende stappen: IPS kweekschaal, neuronale
differentiatie met fibroblast groeifactor (FGF2), insuline en cyclopamine en
volwassen neuronen kweekschalen. Omdat, vele vormen van ataxie verkeerd worden
gediagnosticeerd of dat er jaren voorbij gaan zonder het exacte type te
achterhalen, is het van groot belang dat er een methode wordt ontwikkeld om de
moleculaire en elektrofysiologische ontwikkeling van gezonde en zieke fenotypes
in gespecialiseerde neuronen na te boosten, omdat dit simpelweg niet mogelijk
is in muismodellen. Een voorbeeld hiervan is dat met behulp van micro-array
technologie er nieuwe mogelijkheden ontstaan om gestimuleerde moleculaire banen
in zieke neuronen the correleren met hun elektrofysiologische fenotype.

1. We zullen 6 probands rekruteren die een cerebellaire bewegingsstoornis
ervaren met spinocerebellaire ataxie symptomen, zoals ongecoördineerde beweging
(bv, asthenia, asynergie, vertraagde reactietijd en dyschronometria) in de
ledematen en organen zoals de ogen. Van een huidbiopsie en DNA ontrokken uit
het bloed zullen geïnduceerde pluripotente stamcellen worden gegenereerd. Er
zal worden nagegaan of er, in vitro, cerebellaire neuronen kunnen worden
verkregen van IPS cellen van deze probands. Als de cerebellaire neuronen worden
geproduceerd zal hun biologie worden geëvalueerd door immunohistochemie met
bestaande markers van cerebellaire fysiologie en neuro-degeneratie en 'patch
clamp' technieken voor de elektro-fysiologie.

2. We zullen biologische familieleden van de eerste, tweede en derde generatie
rekruteren, waarvan sommige niet en anderen wel een met een cerebellaire
stoornis zijn gediagnosticeerd. Deze proefpersonen zullen klinisch worden
gediagnosticeerd, ze zullen bloed doneren en er zal een huid biopsie worden
uitgevoerd. Dit alles zal gedaan worden zodat het mogelijk is om vervolgens
cerebellaire neuronen te genereren. Van deze familieleden zullen uiteindelijk
ook de eigenschappen van de cerebellaire neuronen worden onderzocht, waaronder:
de cerebellaire ontwikkeling, neurondegeneratieve markers en de
electro-fysiologische eigenschappen.

Definitie van de proefpersoon groepen:
1. Probands (N=6). De individuen die voldoen aan de criteria van
spino-cerebellaire ataxie en dus een cerebellaire stoornis hebben zullen een
volledige klinische diagnose krijgen en daarnaast zullen ze bloed doneren voor
de extractie van DNA en als laatste zal er een huidbiopsie (4mm) worden
genomen.
2. Familie van de probands (N=5). Familieleden van de eerste, tweede en derde
generatie die beschikbaar zijn, zullen worden gevraagd om bloed te doneren voor
het testen van hun DNA. Ook zullen ze dezelfde klinische diagnose krijgen als
de probands.
De familieleden zullen helpen om de overervingpatronen te verduidelijken en te
evolueren of er bepaalde pathologische genetische variaties in dit onderzoek
zijn die samen overerven binnen de complexe fenotypes in bepaalde families.

Rekrutering:
Probands: De rekrutering wordt uitgevoerd door een lid van de onderzoeksgroep,
dit gebeurt door middel van een verwijzing door een clinicus van het Erasmus
departement van Neuroscience. De verwijzing kan ook worden gedaan door een
familielid of door een confidentiële screening van de dossiers met een
opvolgend contact met de clinicus. De onderzoeker (G.A. Higuera) zal de studie
volledig aan de patiënt uitleggen en zal de informatiebrief aan de patiënt
geven. De patiënt zal in staat zijn om de details van de studie te kunnen lezen
en vasthouden. Nadat de patiënten de tijd hebben gekregen om de informatie
volledig te overwegen en aangemoedigd zijn om vragen te stellen zullen ze
gevraagd worden om geïnformeerde toestemming te geven door het tekenen van het
toestemmingsformulier. Alle toestemmingsformulieren zullen worden getekend en
gedateerd door de onderzoeker. Het is nodig dat er toestemming tot de
aantekeningen van de patiënt wordt verkregen voor verificatie en auditering.
Deze toestemming moet worden verkregen als deel van het toestemmingsproces. De
toestemming formulieren worden gerecenseerd bij het trial centrum en zullen
worden bewaard in het dossier bij de onderzoeker. Een kopie van het getekende
toestemmingsformulier zal aan de patiënt worden gegeven. Een gescheiden logboek
zal alle initialen en de geboortedatum van de patiënt bevatten, gescreend voor
inclusie in de studie. De hoofd onderzoeker zal regelmatig ontmoetingen hebben
met de clinici, om rekrutering te overzien zodat de geschikte patiënten worden
gekozen.

Familieleden: Als het uitvoerbaar is zullen we de probands vragen om aan de
familieleden uit te leggen waarom ze zelf meedoen aan de studie, we zullen ze
de informatiebrief geven en uitleggen waarom de onderzoeksgroep de
geïnteresseerde familieleden wil toevoegen.
Als dit niet uitvoerbaar is zal de onderzoeksgroep de familieleden opzoeken en
vervolgens contact opnemen om de studie uit te leggen, ze de informatiebrief
geven en te vragen of ze deel willen nemen. Het opnemen van contact met de
familieleden van de probands zal alleen worden gedaan wanneer de proband
hiervoor zijn toestemming geeft. Wanneer het familielid toestemt met de
deelname, zal hun toestemming worden gevraagd, voordat er om informatie wordt
gevraagd betreffende bloedmonster, klinische diagnoses en de
familiegeschiedenis.

We verwachten geen serieuze aversieve gebeurtenissen in deze studie. Het
afnemen van een perifeer veneus bloedmonster is een routinematige minimaal
invasieve procedure die alleen uitgevoerd wordt door een gespecialiseerd en
ervaren verpleegkundige en een flebotomist. Bovendien is onze
neuropsychologische diagnostiek uitermate gestructureerd, extensief getest en
is het duidelijk dat er geen serieuze schadelijke gebeurtenissen in voorkomen.
De schadelijke gevolgen die wel kunnen voorkomen zijn onder andere, kleine
blauwe plekken en locale gevoeligheid bij de plek waar het veneuze bloedmonster
is genomen. Tijdens het interview en de neuropsychologische diagnostiek zal de
patiënt volledig bewust zijn van zijn/haar recht om de test, iedere moment en
om wat voor reden dan ook, af te breken.
De Medisch Ethische Toetsingscommissie van het Erasmus MC heeft afgezien van de
verplichting van verzekering. De reden hiervoor is dat ze weinig en/of geen
risico zien in de uitvoering van de studie.

Compensatie:
Probands en familieleden zullen worden gecompenseerd voor hun reizen tijdens
het onderzoek. De proefpersonen zullen worden vergoed met ¤50, - voor de tijd
en inzet in de klinische diagnostiek en het bloedmonster. Daar bovenop zullen
ze worden vergoed met ¤50, - voor het nemen van de huidbiopsie.