De lange termijn effecten van koolteer behandeling op het microbioom en DNA methyloom van atopisch eczeem huid.

Atopische dermatitis: klinische aspecten en behandeling
De mens is geëvolueerd in een constante blootstelling aan micro-organismen en
ons genoom is ongetwijfeld gevormd door de selectiedruk die hiermee gepaard
gaat, zowel van commensalen als externe mogelijk pathogene organismen. Recente
data mede van onze onderzoeksgroep, wijzen er op dat de fysische en chemische
barrière die gevormd wordt door onze huid en ons beschermt tegen infecties, een
rol speelt bij gevoeligheid voor ziekten zoals psoriasis en atopische
dermatitis (AD) [1-3]. Het is zeer waarschijnlijk dat een verstoorde barrière
en daaropvolgende blootstelling aan microbiële agentia bijdraagt aan het
ontstaan of verloop van ziekte. Patiënten met atopische dermatitis worden in
onze kliniek vaak behandeld met koolteer. Het werkingsmechanisme van koolteer
is lange tijd onduidelijk geweest, maar onze onderzoeksgroep heeft recentelijk
aangetoond dat activatie van de koolwaterstofreceptor (AhR) in de huid door
koolteer leidt tot een herstelde huidbarrière en verminderde ontstekingsrespons
[4]. Vaak wordt bij de toepassing van koolteertherapie een lange remissie
periode gezien. Een wetenschappelijke verklaring hiervoor ontbreekt tot op
heden.

Metagenomics
Metagenomics is de studie van genetisch materiaal aanwezig in samples uit het
externe (bodem, oppervlaktewater, huid) of interne (darm,long) milieu. Terwijl
de traditionele microbiologie voornamelijk reincultures van bacteriën bekijkt,
biedt de analyse van 16s rRNA door recente ontwikkelingen de mogelijkheid om
een gedetailleerde analyse te maken van de totale bacteriële flora van een
weefsel (het zogenaamde microbioom). De eerste artikelen over het microbioom
van de huid zijn recentelijk gepubliceerd [5, 6]. De zogenaamde deep-sequencing
technologie is hiervoor cruciaal. Deze maakt het mogelijk om een complete
analyse te maken van alle bacteriën die aanwezig zijn op de huid. Gezien de
relatie tussen het microbioom van de huid en het ziekteverloop van atopische
dermatitis [7], zou het herstel van een normaal microbioom een mogelijk
therapeutisch effect kunnen hebben.
Epigenetica
Epigenetica is de studie naar erfelijke veranderingen in gen activiteit die
niet veroorzaakt worden door veranderingen in de DNA sequentie. Veranderingen
in het epigenoom, zoals bijvoorbeeld methylatie van het DNA, kunnen invloed
hebben op de toegankelijkheid van het DNA. De methyloom status van het DNA kan
geanalyseerd worden en met deze informatie kan een inschatting gemaakt worden
van de processen waarmee de cel of het weefsel op dat moment doende is.
Epigenetische veranderingen in het DNA kunnen geanalyseerd worden door middel
van verschillende analysemethoden en het is aannemelijk dat deze veranderingen
een rol kunnen spelen in cellulaire differentiatie en epidermale morfogenese.
Recente studies hebben aangetoond dat onder andere bij psoriasis het
ziektebeeld veroorzaakt of versterkt kan worden door epigenetische
veranderingen in de huid [8]. Daarnaast hebben pilot studies laten zien dat
huidspecifieke verschillen in DNA methylatie een rol spelen in atopische
dermatitis [9].

1. Palmer, C.N., et al., Common loss-of-function variants of the epidermal
barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic
dermatitis. Nat Genet, 2006. 38(4): p. 441-6.
2. Hollox, E.J., et al., Psoriasis is associated with increased beta-defensin
genomic copy number. Nat Genet, 2008. 40(1): p. 23-5.
3. de Cid, R., et al., Deletion of the late cornified envelope LCE3B and LCE3C
genes as a susceptibility factor for psoriasis. Nat Genet, 2009. 41(2): p.
211-5.
4. van den Bogaard, E.H., et al., Coal tar induces AHR-dependent skin barrier
repair in atopic dermatitis. J Clin Invest, 2013. 123(2): p. 917-27.
5. Gao, Z., et al., Substantial alterations of the cutaneous bacterial biota in
psoriatic lesions. PLoS One, 2008. 3(7): p. e2719.
6. Grice, E.A., et al., Topographical and temporal diversity of the human skin
microbiome. Science, 2009. 324(5931): p. 1190-2.
7. Kong, H.H., et al., Temporal shifts in the skin microbiome associated with
disease flares and treatment in children with atopic dermatitis. Genome Res,
2012. 22(5): p. 850-9.
8. Roberson, E.D., et al., A subset of methylated CpG sites differentiate
psoriatic from normal skin. J Invest Dermatol, 2012. 132(3 Pt 1): p. 583-92.
9. Rodriguez, E., et al., An Integrated Epigenetic and Transcriptomic Analysis
Reveals Distinct Tissue-Specific Patterns of DNA Methylation Associated with
Atopic Dermatitis. J Invest Dermatol, 2014.

Wij hypothetiseren dat de langdurige therapeutische effecten van koolteer
veroorzaakt kunnen worden door effecten op het microbioom van de huid en/of op
de epigenetica van de huidcellen. Het huid microbioom van atopische dermatitis
patiënten die behandeld worden met koolteer zou dusdanig beïnvloed kunnen
worden dat kolonisatie van S.aureus vermindert, waardoor een *normaal* huid
microbioom zou ontstaan (dat grotendeels bestaat uit S.epidermidis en P.acnes
bestaat, zonder aantoonbare aanwezigheid van S.aureus). Daarnaast zou het
kunnen dat koolteer een effect heeft op de epigenetica van epidermale
(stam)cellen of lymfocyten, waardoor de huid enige tijd hersteld blijft. Beide
hypothesen kunnen een verklaring opleveren voor de lange remissietijd die
gebruik van koolteer vaak laat zien.

De hypothesen worden onderzocht in
(A) Een korte studie in gezonde vrijwilligers naar het effect van koolteer op
het huid microbioom.
(B) Een langdurige studie in AD patiënten naar het effect van koolteer op het
microbioom van de aangedane huid. De studie gaat plaatsvinden in een
*dagelijkse praktijk* setting.
(C) Een pilot studie om te onderzoeken of behandeling van de aangedane huid van
AD patiënten met koolteer veranderingen teweeg brengt in de epigenetica van de
huidcellen.

A. HET EFFECT VAN KOOLTEER OP HET HUIDMICROBIOOM VAN GEZONDE VRIJWILLIGERS
Ons doel is om te onderzoeken wat het effect is van koolteer op het huid
microbioom van gezonde vrijwilligers (n=10). Drie oppervlakken (4 x 4 cm,
verdeeld over 4 kwadranten) op de onderrug worden als volgt behandeld:
1. Controle zonder behandeling
2. Lanette/vaseline gevolgd door zinc-oxide pasta (basis crème)
3. Koolteeroplossing (LCD) 10% in lanette/vaseline gevolgd door koolteer (pix
lithantracis) 5% in zinc oxide pasta
De behandeling wordt gestopt op dag 7. Huidschraapsels (niet invasief) worden
genomen voor, tijdens en na behandeling op dag 0, 2, 7 en 14 van de vier
kwadranten. Microbieel DNA wordt geëxtraheerd uit de huidschraapsels en wordt
geanalyseerd. Alle gezonde vrijwilligers krijgen een reiskostenvergoeding op
basis van openbaar vervoer en krijgen een vergoeding van ¤50,-- voor deelname
aan de studie.
Methodologische overwegingen
Dit is een studie op het huidmicrobioom van een kleine groep individuen. De
analyse van het huidmicrobioom zal een enorme hoeveelheid experimentele data
opleveren (>10.000 datapunten per monster, wat vergelijkbaar is met microarray
studies). Dit gaat gepaard met een grote kans op mogelijke vals-positieve
uitkomsten (familywise errors). Om deze reden zal de analyse zich voornamelijk
focussen op verschuivingen binnen het microbioom, in plaats van op de
kwantitatieve vergelijking tussen de vele bacteriën.

Analyse van het huidmicrobioom
Microbieel DNA uit de huidschraapsels wordt geëxtraheerd en opgewerkt met
behulp van universele 16S rRNA primers en wordt gesequenced met behulp van
geavanceerde deep sequencing technologie. Omdat de technologie in dit
onderzoeksveld zich in een razendsnel tempo ontwikkelt, wordt er pas in een
later stadium beslist welke techniek we zullen gaan gebruiken voor de analyses.
Bioinformatica analyse wordt uitgevoerd in samenwerking met het NIZO
(Nederlands Instituut voor Zuivelonderzoek, Ede, Nederland) en het CMBI (Centre
for Molecular BioInformatics, RIMLS, Radboudumc, Nijmegen). Een soortgelijke
studie heeft eerder succesvol plaatsgevonden (zie CMO 1243) en heeft geleid tot
een publicatie door Zeeuwen et al. (Genome Biol. 2012 Nov 15;13(11):R101).

B. HET EFFECT VAN KOOLTEER OP HET HUIDMICROBIOOM VAN ECZEEM PATIENTEN
Het doel is om het huidmicrobioom van volwassen patiënten met atopische
dermatitis voor, tijdens en na behandeling met koolteer te volgen (n=10). We
willen de effecten van koolteer behandeling op het microbioom van de huid
vaststellen. De behandeling van atopische dermatitis met koolteer is een
standaard behandeling binnen onze afdeling. Patiënten die in aanmerking komen
voor behandeling met koolteer worden benaderd of zij willen participeren in dit
onderzoek. Patiënten die reeds behandeling met koolteer ontvangen worden niet
benaderd voor dit onderzoek. Patiënten die reeds therapie krijgen, zoals
bijvoorbeeld corticosteroiden, mogen wel mee doen aan dit onderzoek. Twee
gebieden met lesionale huid, bij voorkeur de elleboogsplooi (ca. 5 x 8 cm)
worden verdeeld in vier kwadranten en als volgt behandeld:

Oppervlak 1: Lanette/vaseline gevolgd door zinc-oxide pasta (basis crème)
Oppervlak 2: Koolteeroplossing (LCD) 10% in lanette/vaseline gevolgd door
koolteer (pix lithantracis) 5% in zinc oxide pasta
Vijf patiënten krijgen de behandeling met lichte koolteer en donkere koolteer
op hun linkerarm, en de basis crème op de rechterarm. De overige 5 patiënten
worden precies tegenovergesteld behandeld. De behandeling met koolteer is
hetzelfde als de behandeling die normaal gesproken met koolteer wordt
uitgevoerd. Patiënten worden door de medisch onderzoeker voorgelicht en de
behandeling wordt uitgelegd, zodat patiënten deze thuis kunnen voortzetten.
Gedurende de eerste twee weken van de behandeling worden er vier controle
momenten ingepland. Tijdens de derde week van het onderzoek gaan de patiënten
over op de normale koolteer behandeling.
Huidschraapsels zullen genomen worden aan het begin van het onderzoek (t=0) en
tijdens de drie daaropvolgende controlebezoeken. Wanneer de behandeling stopt
(normaal gesproken tussen week 4 en week 12) zal er een laatste huidschraapsel
genomen worden, enkel van oppervlak 2. Vervolgens wordt de patiënten verzocht,
indien zij het gevoel hebben dat hun eczeem terug komt, contact op te nemen met
ons. Vervolgens kan van oppervlak 2 opnieuw een huidschraapsel genomen worden.
Patiënten die participeren in ons onderzoek krijgen de reiskosten van de
ongeplande bezoeken vergoed op basis van openbaar vervoer. Naast de reiskosten
krijgen zij ook een vergoeding voor het meedoen aan deze studie (¤50,--) en
krijgen zij een additionele vergoeding van ¤50,-- wanneer zij contact opnemen
met ons zodra het atopische eczeem terugkomt, en zij opnieuw materiaal zullen
afstaan.

Methodologische overwegingen
Door praktische, ethische en financiële overwegingen hebben wij getracht om een
zo eenvoudig mogelijke studie op te zetten. Hierbij willen we zo min mogelijk
interfereren met de dagelijkse praktijk en daarmee ook de belasting voor de
patiënt te beperken tot een minimum. Met de opzet zoals hierboven beschreven
denken we voldoende bruikbare informatie te kunnen genereren.
Dit is een studie op het huidmicrobioom van een kleine groep individuen. De
analyse van het huidmicrobioom zal een enorme hoeveelheid experimentele data
opleveren (>10.000 datapunten per monster, wat vergelijkbaar is met microarray
studies). Dit gaat gepaard met een grote kans op mogelijke vals-positieve
uitkomsten (familywise errors). Om deze reden zal de analyse zich voornamelijk
focussen op verschuivingen binnen het microbioom, in plaats van op de
kwantitatieve vergelijking tussen de vele bacteriën.

Analyse van het huidmicrobioom
Microbieel DNA uit de huidschraapsels wordt geëxtraheerd en opgewerkt met
behulp van universele 16S rRNA primers en wordt gesequenced met behulp van
geavanceerde deep sequencing technologie. Omdat de technologie in dit
onderzoeksveld zich in een razendsnel tempo ontwikkelt, wordt er pas in een
later stadium beslist welke techniek we zullen gaan gebruiken voor de analyses.
Bioinformatica analyse wordt uitgevoerd in samenwerking met het NIZO (Ede,
Nederland) en het CMBI (RIMLS, Radboudumc, Nijmegen). Een soortgelijke studie
heeft eerder succesvol plaatsgevonden (zie CMO 1243) en heeft geleid tot een
publicatie door Zeeuwen et al (Genome Biol. 2012 Nov 15;13(11):R101).

C. EFFECT VAN KOOLTEER OP HET DNA METHYLOOM VAN DE HUID
In een pilot studie (3 patiënten) willen we onderzoeken of er aanwijzingen zijn
dat epigenetische veranderingen optreden in de huid van atopische dermatitis
patiënten onder invloed van koolteer behandeling. Mochten we inderdaad een
indicatie krijgen voor epigenetische veranderingen , dan zal er een grotere
studie opgezet worden. De studie zal gedaan worden bij 3 atopische dermatitis
patiënten. Bij aanvang van de studie zullen er 3 huidbiopten (4 mm) genomen
worden van de lesionale huid als uitgangswaarde van de methyloomstatus.
Vervolgens wordt aangedane huid behandeld met (koolteeroplossing (LCD) 10% in
lanette/vaseline gevolgd door koolteer (pix lithantracis) 5% in zinc-oxide)
gedurende 7 dagen. Na zeven dagen worden er opnieuw 3 huidbiopten (4 mm)
genomen.
Patiënten die participeren in ons onderzoek krijgen de reiskosten van de
ongeplande bezoeken vergoed op basis van openbaar vervoer. Naast de reiskosten
krijgen zij ook additionele vergoeding van ¤15,-- per afgenomen huidbiopt.

Analyse van het huid DNA methyloom
De DNA methyloom status wordt geanalyseerd in samenwerking met de afdeling
Moleculaire Biologie (RIMLS, Radboudumc, Nijmegen). Omdat de technologie in dit
onderzoeksveld zich in een razendsnel tempo ontwikkelt, wordt er pas in een
later stadium beslist welke techniek we zullen gaan gebruiken voor de analyses.
Bioinformatica analyse zal in samenwerking met het CMBI (RIMLS, Radboudumc,
Nijmegen) uitgevoerd worden.

Het verzamelen van huidschraapsels is niet invasief en brengt daarmee slechts
een zeer geringe last mee voor de deelnemers aan studie A en B. Huidbiopten,
zoals afgenomen bij studie C, herstellen in de regel zonder complicaties en
laten slechts een klein litteken achter. Personen waarvan bekend is dat zij
vaker hypertrofe littekens of keloïden ontwikkelen worden geëxcludeerd. Geen
van de vrijwilligers en patiënten zullen directe voordelen ondervinden van de
studies.
Patiënten die deelnemen van studie B worden gedurende de eerste twee weken van
de studie belast. Zij krijgen op één van beide armen geen koolteer behandeling
maar worden ingesmeerd met basis crème zonder koolteer. Na de tweede week
worden wel beide armen behandeld met koolteer.