Bepaling en farmacologische correctie van defecten in chloride (Cl-), bicarbonaat (HCO3-) en mucus transport in rectumbiopten van CF patiënten

Cystic fibrosis (CF; mucoviscidose) wordt gekenmerkt door de ophoping van taai
slijm (mucus) in epitheelweefsels waardoor de afvoer van bacteriën in de
longen, van spijsverteringsenzymen en gal in de pancreas en galgangen, en van
voedselresten in de darm belemmerd wordt. Recent onderzoek in CF muis modellen
laat zien dat voor de normale uitscheiding van mucus een gelijktijdige secretie
van bicarbonaat (HCO3-) nodig is en dat de vorming van taai slijm een gevolg is
van een defect in de uitscheiding van bicarbonaat in CF. Bij de mens is tot nu
toe alleen het rectumslijmvlies toegankelijk om na biopt afname zowel HCO3- als
chloride en mucus secretie te meten en een mogelijk corrigerend effect van
farmaca op CF defecten in deze functies buiten het lichaam te testen.
In het verleden werd de HCO3- secretie van het darmepitheel alleen gemeten in
de dunne darm [9,10], de invloed van het colon werd verwaarloosbaar geacht.
Echter, recente studies in distaal colon van CF muizen en van muizen die een
Ca2+-geactiveerd chloride/bicarbonaat kanaal in de basolaterale membraan van
gobletcellen, het bestrofine2 (Best2), missen, laten zien dat een aanzienlijk
deel van de anion stroom na stimulatie met de Ca2+ agonist carbachol HCO3- en
Best2 afhankelijk is, en dat Best2 in serie met apicale Cl-/HCO3- uitwisselaars
intraluminale HCO3- secretie kan uitvoeren, parallel aan mucinesecretie. [11]
Het uitgescheiden bicarbonaat bevordert de secretie en volume expansie van het
mucus uit de gobletcellen via locale pH verhoging en sequestratie van Ca2+
ionen.[12] Ook kunnen colon crypten HCO3- secreteren via een basolaterale NBC1
Na+/HCO3- cotransporter en apicale CFTR kanalen, en kunnen cellen aan het
epitheeloppervlak netto secretie van HCO3- uitvoeren via de apicale SLC26a3
Cl-/HCO3- uiwisselaar onder condities waarin de NHE3 Na+/H+ uitwisseling is
geremd door Ca2+, cAMP- of cGMP-verhogende secretagogen. [10,13]
De HCO3- secretie in CF colon kan defect zijn door verschillende oorzaken:
disfunctie van CFTR, dat zelf als een HCO3-kanaal kan dienen of als een Cl-
shunt om SLC26a3 gemedieerde HCO3- secretie te faciliteren [10]; verminderde
expressie van Best2 [11]; of verminderde expressie van HCO3- producerende
enzymen, zoals de carbonzuuranhydrases Car2 en Car4. [14]
Tot nu toe heeft onderzoek naar HCO3- secretie voornamelijk plaatsgevonden in
knaagdiermodellen en zijn er weinig of geen gegevens over humaan colon.
Bovendien is de HCO3- secretie uitsluitend onderzocht met behulp van
transepitheliale ionen stroom metingen, waarbij alleen de electrogene en niet
de electroneutrale component geregistreerd wordt .
Verbazingwekkend genoeg is er nog minder bekend over het vermogen van CFTR
correctors om, naast hun invloed op het transepitheliale Cl- transport, ook
defecten in HCO3- en mucine secretie te corrigeren .[15] Helaas geeft tot nu
toe geen enkele parameter in klinisch onderzoek (NPD, zweettest, FEV1, etc)
directe informatie over HCO3- en mucine secretie in CF-aangedaan epitheel.
Daarom zijn onderzoeken naar meting van HCO3- en mucine secretie in gemakkelijk
bereikbaar weefsel (zoals rectumbiopten) dringend noodzakelijk.

Dit project heeft tot doel om de nieuwe inzichten in het mechanisme van HCO3-
en mucus transport uit recente studies in CF muismodellen te toetsen in
rectumbiopten van controle personen en van CF patiënten. Hiertoe worden de
biopten in een zgn. Ussing kamer electrofysiologisch en biochemisch onderzocht
op hun vermogen om HCO3- en mucus uit te scheiden. Vervolgens wordt ex vivo het
vermogen van een aantal recent ontwikkelde farmaca (zgn. CFTR correctors;
onstekingsremmers, met name PPAR-gamma agonisten; en remmers van de Na+/H+
uitwisselaar NHE3) onderzocht om het defect in Cl-, HCO3- en/of mucus
uitscheiding te corrigeren. De hiervoor benodigde electrofysiologische
technieken zijn in de laatste 2 decennia door de aanvragers ontwikkeld en
geperfectioneerd, maar tot nu toe alleen toegepast om het chloride (Cl-)
transport defect in het CF darmslijmvlies te meten, waarbij de bijdrage van
HCO3- aan de ionenstroom nog niet is geevalueerd (zie de Engelse versie voor
een meer gedetaileerde beschrijving van de doelstellingen).

1. Bestuderen van HCO3- secretie, stase van mucus en expressie en localisatie
van transporteiwitten en enzymen die betrokken zijn bij HCO3- secretie in
rectale biopten van gezonde vrijwilligers en CF patienten.

Transepitheliale ionen stroom metingen in rectale zuigbiopten van gezonde
vrijwilligers en homozygote F508del CF patienten (4 per patient) zullen worden
uitgevoerd in de *Rotterdam* mini-Ussing kamers (oppervlak 1.13 mm2), verbonden
met een DVC-1000 voltage clamp (WPI) en Powerlab voor digitalizatie en
registratie (LabChart software), zoals gedetailleerd beschreven in ref. 6. De
serosale oplossing (Meyler buffer met 10 mM glucose) circuleert door een
carbogeen gas-lift systeem (95% O2, 5% CO2) bij pH 7.4, en de ongebufferde
oplossing aan de luminale zijde (154 mM NaCl met 10 µM amiloride ENaC
kanaaltjes te remmen) circuleert m.b.v. 100% O2. Na een equilibratietijd van 1
uur wordt de electrogene component van het basale and secretagoog-gestimuleerde
anionen transport (i.e. HCO3- + Cl-) bepaald door middel van short-circuit
current (Isc) metingen, en de totale HCO3- secretie (i.e.
electrogeen+electroneutraal) door meting van de luminale alkalinisatie met
behulp van een continue pH-stat titratiemethode (Radiometer, Copenhagen).
Hierbij wordt de luminale pH constant gehouden op 7.4 door toevoeging van een
isotone oplossing met 2 mM HCl uit een automatische buret (*pH stat* methode).
Vervolgens worden de secretagogen uitgewassen door de oplossing meerdere malen
te vervangen, en de Isc metingen worden herhaald na isotone vervanging van
HCO3- aan de serosale zijde door Na-HEPES (pH 7.4) en Na-gluconaat, bilaterale
toevoeging van de Car remmer methazolamide (100 µM), en overgang op 100% O2
gas. De electrogene component van het HCO3- transport wordt bepaald door
vergelijking van de Isc responsen in de eerste en tweede periode, in aan- en
afwezigheid van serosaal HCO3-.
Om de HCO3- secretie respons op verschillende intracellulaire signalen te
evalueren, zullen de volgende secretagogen achtereenvolgens getest worden:
carbachol (Ca2+-verhogend)-[uitwassen]-guanyline (cGMP-verhogend)-STa
(idem)-[uitwassen]- forskolin+ IBMX (cAMP-verhogend)-genistein (verbetert de
transportfunctie van F508del-CFTR)-carbachol.
De HCO3- en mucus secretie meting zullen eerst in muize darmepitheel worden
uitgetest om de methode te optimaliseren.

In aparte experimenten zal de bijdrage van het Ca2+-afhankelijke anionkanaaltje
bestrophine-2 aan de HCO3- secretie in humaan colon epitheel worden bepaald
door vergelijking van Isc and pH-stat responsen na toevoeging van carbachol in
aan- of afwezigheid van de Best2 remmer indomethacin.[11] Hierbij zal PGE2
worden toegevoegd als compensatie voor de remming van endogene PGE vorming door
indomethacine.

Stase van mucus zal worden bepaald door Alcian Blue kleuring van
biopten[11,14,17]. De expressie en (re)distributie van ionen transporteurs
(CFTR, Best2) en enzymen (Car4, Car2) in de biopten zal worden onderzocht met
behulp van immunokleuring en confocale microscopie. [11,14]

Wij schatten dat voor het uitvoeren van onderdeel 1 van deze studie de
participatie nodig is van 10 gezonde proefpersonen en 8 CF patienten (5
biopten/patient).

2. Ex vivo repair van CF defecten in HCO3- secretie and mucus excretie in het
colon door farmaca.

We hebben recent condities voor weefselbehoud vastgesteld waarin humane rectale
biopten in een Ussing kamer bij 37C tenminste 24u volledig functioneel
blijven. Ons doel is die bevinding in dit project te gebruiken om ex vivo de
lange termijn effecten te testen van 3 verschillende klassen potentiele
farmacologische correctors in rectale biopten van homozygote F508del CF
patienten:

(i) Correctors van F508del misprocessing waarvan bekend is dat ze verbetering
geven van het CFTR-afhankelijke Cl- transport, maar die nog niet zijn getest op
hun vermogen om HCO3- and mucus transport bij CF te verbeteren. De Vertex
corrector VRT-809, waarvan eerder werd gevonden dat deze CFTR-afhankelijke Cl-
secretie verbetert in humane bronchiale epithelial cellen (nu in de klinische
testfase), zal het eerst worden getest als een positieve controle. Tevens
zullen 4 recent door EPIX ontwikkelde F508del-CFTR correctors (ons ter
beschikking gesteld door de CFFT-USA) in hetzelfde protocol worden getest. Na
de Isc en pH-stat metingen in verse biopten als bescheven onder (1), zullen de
biopten 24u worden geincubeerd in aanwezigheid van de CFTR corrector of
vehicle (2 biopten/conditie), gevolgd door herhaling van de Isc en pH-stat
metingen en Alcian Blue staining.

(ii) Potentiele correctors van het defect in PPAR-γ signaling in CF, i.e. de
synthetische PPAR-γ ligand rosiglitazon[14] en het bicyclische vetzuur en PGE1
afgeleide lubiproston [18], beide klinisch in gebruik voor behandeling van
respectievelijk diabetes type 2 en chronische obstipatie.

(iii) S3226 (beschikbaar gesteld door Sanofi Aventis), een nieuwe remmer van
NHE3 die mogelijk de positieve effecten van NHE3-KO op CF pathologie (o.a.
stimulatie van HCO3- secretie) imiteert zoals eerder aangetoond in Cftr-/-
muizen. [17]

We schatten dat voor het uitvoeren van onderdeel 2 van deze studie (testen van
8 potentiele correctors) de participatie nodig is van 32 F508del CF patienten.
Poweranalyse laat zien dat, voor het aantonen van een statistisch significante
verbetering van anion secretie in de Ussing kamer door een corrector (tot een
Isc waarde >10% van gezonde controles) elke corrector of vehicle dient te
worden getest in 2 biopten van tenminste 4 CF patienten.

Werving gezonde proefpersonen en CF patienten:
Na informed consent op papier en met toestemming van de medisch ethische
commissie van het UMCU, zullen rectale biopten (5/proefpersoon) worden
afgenomen bij volwassen homozygote F508del CF patienten en gezonde
vrijwilligers met behulp van een zuigbiopteur (Meeker Instruments, Utrecht) en
precies verwerkt worden zoals eerder beschreven. [18]

Belasting en risico afname rectumbiopt: minimaal

Risico van bloeding volgens literatuur:
N= 389, comp. 2 (bleeding 0.5%) [19]