Leucine suppletie ter vermindering van skeletspier atrofie tijdens kort durende immobilisatie

Blessures, ziekte en het herstel hiervan gaan gepaard met perioden waarbij de
skeletspieren niet gebruikt worden. De inactiviteit tijdens deze perioden
resulteerd in een verlies van skeletspier massa (1), welke een negatieve
invloed heeft op de gezondheid, waaronder een afname in kracht (1),
ontwikkeling van insuline resistentie (2), een afname in basaal metabolisme
(basal metabolic rate) (3), en een toename van lichaamsvet (4). Deze condities
zijn geassocieerd met vroegtijdige fysieke kwetsbaarheid (5), een toename in de
kosten van de gezondheidszorg (5), en een verhoogd risico op sterfte (6). Het
gebrek aan het gebruiken van de spieren vormt een groot gezondheidsprobleem
voor de ouderen, die al een verhoogd risico hebben op sarcopenie, of een
verlies in leeftijd gerelateerd verlies in skeletspier massa en kracht (7).
Perioden waarbij de skeletspieren niet worden gebruikt zijn veel voorkomend bij
ouderen, en representeren een periode van *katabole crisis* welke de
ontwikkeling van sarcopenie versnellen (7). Ouderen (>60 jaar) zijn de snelst
groeiende leeftijdsgroep. Er wordt voorspeld dat tegen 2050 ~21% van de
wereldbevolking tot deze leeftijdsgroep zal behoren (8). Populatiestudies tonen
aan dat >20% van de bevolking tussen de 60-70 leiden aan sarcopenie en ~50 van
de bevolking >75 jaar (9). De gezondheidskosten toe te schrijven aan sarcopenie
bedroegen ~$18.5 miljard in 2000 (8). Het is duidelijk van essentieel belang om
effectieve strategieën te ontwikkelen om het verlies van spiermassa en kracht,
als gevolg van het niet gebruiken van de spieren tegen te gaan. Dit om een
epidemie van fysieke kwetsbaarheid en een verlies van zelfstandigheid bij
ouderen te voorkomen alsmede het risico op ziekte en sterfte te verminderen.
Humane inactiviteit/immobilisatie studies zijn uitgevoerd in jonge gezonde
proefpersonen over perioden van meer dan 10 dagen (10). Deze studies hebben
laten zien dat 10-42 dagen van inactiviteit leiden tot een verlies in
spierkracht van 0.3-4.2% per dag (10). Echter het verlies in spiermassa als
gevolg van inactiviteit vindt voornamelijk plaats in het vroege stadium van een
periode van inactiviteit (7). Hiertoe leiden slechts 5 dagen van inactiviteit
al tot een substantieel verlies van spiermassa (11). Dit is een groot probleem
voor ouderen aangezien voorheen is aangetoond dat het verlies in spiermassa en
functie als gevolg van 14 dagen immobilisatie nog niet volledig is hersteld na
4 weken met intensieve krachttraining (12). Hiertoe hebben we voorheen
aangetoond dat slechts 5 dagen van immobilisatie in oudere mannen resulteert in
een 1,5% verlies in de oppervlaktedoorsnede (cross sectional area) van de
quadriceps (13). Op heel lichaamsniveau zou dit betekenen dat 5 dagen van
bedrust zou resulteren in een spierverlies van ~1kg. Dus zelfs als men voor
~80% zou herstellen van dit spierverlies, na 2 korte periodes van
ziekte/blessure op een jaar zou men toch nog ~400g spier verliezen. Dit zou
resulteren in een spiermassaverlies van 0.8% per jaar en voor een groot
gedeelte bijdragen aan het geschatte spiermassaverlies van 1-2% per jaar na het
50ste levensjaar (14). Momenteel is er weinig bekent over de fysiologische
mechanismen die spieratrofie veroorzaken tijdens korte perioden van
inactiviteit. Spiermassa wordt bepaald door de balans tussen de snelheid van
spiereiwitsynthese (SES) en spiereiwitafbraak (SEA). Wanneer SEA groter is dan
SES, zal dit resulteren in een negatieve balans van de eiwitten en zorgen voor
spiermassa verlies. Anabole stimulatie door voedingsstoffen, voornamelijk
eiwitten, zijn fundamenteel voor het behouden van skeletspiermassa, daar deze
de toename in spiermassa reguleren. Echter afnames in basale en postprandiale
SES zijn waargenomen na 5-42 dagen van bedrust en been immobilisatie (10).
Echter, het is onduidelijk of er ook veranderingen plaatsvinden in SEA, daar er
een gebrek is aan metingen van SEA tijdens inactiviteit. Door het gebrek aan
metingen van SEA hebben studies gekeken naar bewijs voor een verhoogde
activiteit van het ubiquitine-proteasoom systeem na inactiviteit als een
indicator voor een toename SEA (10). Dit systeem en zijn enzymen zijn
geactiveerd onder katabole omstandigheden. Echter, inconsistente moleculaire
bevindingen, evenals een gebrek aan data betreffende SEA, maken het moeilijk om
duidelijk vast te stellen wat de bijdrage is van SEA aan spier atrofie tijdens
inactiviteit. Het aminozuur leucine wordt beschouwd als een unieke voedingsstof
welke spiereiwit metabolisme reguleert door SES te stimuleren en SEA te
inhiberen door proteasomale afbraak te onderdrukken (15). Leucine blijkt
spieratrofie in diermodellen te inhiberen, deels door een afname van SEA (15).
Echter, er is geen informatie beschikbaar over de impact van leucine suppletie
op dynamische metingen van SES en SEA, markers van het ubiquitine-proteasoom
systeem en skeletspiermassa tijdens inactiviteit bij mensen.

REFERENTIES

1. Deitrick JE. The effect of immobilization on metabolic and physiological
functions of normal men. Bulletin of the New York Academy of Medicine
1948;24(6):364-75.
2. Stuart CA, Shangraw RE, Prince MJ, Peters EJ, Wolfe RR. Bed-rest-induced
insulin resistance occurs primarily in muscle. Metabolism: clinical and
experimental 1988;37(8):802-6.
3. Haruna Y, Suzuki Y, Kawakubo K, Yanagibori R, Gunji A. Decremental reset in
basal metabolism during 20-days bed rest. Acta physiologica Scandinavica
Supplementum 1994;616:43-9.
4. Ferrando AA, Lane HW, Stuart CA, Davis-Street J, Wolfe RR. Prolonged bed
rest decreases skeletal muscle and whole body protein synthesis. The American
journal of physiology 1996;270(4 Pt 1):E627-33.
5. Strawbridge WJ, Shema SJ, Balfour JL, Higby HR, Kaplan GA. Antecedents of
frailty over three decades in an older cohort. The journals of gerontology
Series B, Psychological sciences and social sciences 1998;53(1):S9-16.
6. Metter EJ, Talbot LA, Schrager M, Conwit R. Skeletal muscle strength as a
predictor of all-cause mortality in healthy men. The journals of gerontology
Series A, Biological sciences and medical sciences 2002;57(10):B359-65.
7. English KL, Paddon-Jones D. Protecting muscle mass and function in older
adults during bed rest. Current opinion in clinical nutrition and metabolic
care 2010;13(1):34-9. doi: 10.1097/MCO.0b013e328333aa66.
8. Janssen I, Shepard DS, Katzmarzyk PT, Roubenoff R. The healthcare costs of
sarcopenia in the United States. Journal of the American Geriatrics Society
2004;52(1):80-5.
9. Berger MJ, Doherty TJ. Sarcopenia: prevalence, mechanisms, and functional
consequences. Interdisciplinary topics in gerontology 2010;37:94-114. doi:
10.1159/000319997.
10. Wall BT, Dirks ML, van Loon LJ. Skeletal muscle atrophy during
short-term disuse: implications for age-related sarcopenia. Ageing research
reviews 2013;12(4):898-906. doi: 10.1016/j.arr.2013.07.003.
11. Wall BT, Dirks ML, Snijders T, Senden JM, Dolmans J, van Loon LJ.
Substantial skeletal muscle loss occurs during only 5 days of disuse. Acta
Physiol (Oxf) 2014;210(3):600-11. doi: 10.1111/apha.12190.
12. Suetta C, Hvid LG, Justesen L, Christensen U, Neergaard K, Simonsen
L, Ortenblad N, Magnusson SP, Kjaer M, Aagaard P. Effects of aging on human
skeletal muscle after immobilization and retraining. J Appl Physiol
2009;107(4):1172-80. doi: 10.1152/japplphysiol.00290.2009.
13. Dirks ML, Wall BT, Nilwik R, Weerts DH, Verdijk LB, van Loon LJ.
Skeletal muscle disuse atrophy is not attenuated by dietary protein
supplementation in healthy older men. The Journal of nutrition
2014;144(8):1196-203. doi: 10.3945/jn.114.194217.
14. Nair KS. Aging muscle. The American journal of clinical nutrition
2005;81(5):953-63.
15. Dodd KM, Tee AR. Leucine and mTORC1: a complex relationship.
American journal of physiology Endocrinology and metabolism
2012;302(11):E1329-42. doi: 10.1152/ajpendo.00525.2011.

Primaire doelen

1. Het bepalen van de impact van een kort durende (3 dagen) been immobilisatie
op de *cummulatieve* snelheid van spiereiwit synthese in jonge en oudere
volwassenen.
2. Bepalen of leucine suppletie de vermindering in cummulatieve
spiereiwitsynthese en spiermassa als gevolg van 3 dagen immobilisatie kan
voorkomen in jonge en oudere volwassenen.
3. Bepalen of spiereiwitafbraak verhoogd is en spiereiwit synthese verminderd
is in nuchtere toestand na 3 dagen van inactiviteit door immobilisatie in jonge
volwassenen.
4. Bepalen of leucine suppletie spiereiwitafbraak kan verminderen,
spiereiwitsynthese kan verhogen en het verlies in spiermassa tijdens 3 dagen
immobilisatie in jonge volwassenen kan verminderen.


Hypothesen

1. In zowel jonge als oudere volwassenen zal 3 dagen van inactiviteit door
immobilisatie van een been resulteren in spieratrofie welke ook gepaard gaan
met een afname in de snelheid van *cumulatieve* spiereiwitsynthese tijdens
ziekte.
2. In zowel jonge als oudere volwassenen zal leucine suppletie tijdens 3 dagen
van inactiviteit door immobilisatie van een been resulteren in een vermindering
van de daling in de cumulatieve spiereiwitsynthese en het verlies van
spiermassa.
3. 3 dagen van inactiviteit door immobilisatie van een been zal resulteren in
een toename van de snelheid van spiereiwitafbraak en een afname van de snelheid
in spiereiwitsynthese in nuchtere jonge volwassenen.
4. Leucine suppletie tijdens 3 dagen van inactiviteit door immobilisatie van
een been zal resulteren in een vermindering van zowel de toename van de
snelheid van spiereiwitafbraak als de afname van de snelheid in
spiereiwitsynthese, in nuchtere jonge volwassenen.

Study Design
Vierentwintig (12 mannen en 12 vrouwen) jongere (18 tot en met 35 jaar) en
vierentwintig (12 mannen en 12 vrouwen) oudere (60 tot en met 80 jaar) zullen
gevraagd worden om 3 dagen een been te laten immobiliseren. De proefpersonen
zullen matig actief zijn, maar geen structureel trainingsprogramma aan het
volgen zijn. De volgende exclusiecriteria zullen worden gehandhaafd:
klachten/blessures aan de benen en/of rug, een geschiedenis van
trombose/cardiovasculaire ziekten, gebruik van anticoagulantia,
skeletspier/orthopedische afwijkingen, het structureel uitvoeren van
krachttraining, gebruik van corticosteroïden, gebruik van eiwitsupplementen
tijdens de studie, diabetes, zwangerschap, hormoon vervangingstherapie, derde
generatie orale anticonceptiva en gebruik van tabaksproducten. De volgende
inclusiecriteria worden gehandhaafd: matig actief (zie hierboven), man of vrouw
in de leeftijd van 18 tot en met 35 of 60 tot en met 80 jaar en een BMI tussen
de 18.5 en 30 (inclusief).

Screening
Proefpersonen die op de advertentie reageren zullen via telefoon/e-mail
geinformeerd worden over de study. Tevens zullen we hen voorzien met de
informatiebrochure en toestemmingsverklaring welke ze zullen meenemen naar de
screening.
Om te bepalen of de proefpersonen geschikt zijn om deel te nemen aan dit
onderzoek, zullen zij worden uitgenodigd voor een screeningsbezoek op de
universiteit. Voordat de screening start zullen we alle testen en metingen die
worden uitgevoerd aan hun uitleggen en eventuele vragen beantwoorden. We zullen
hun vragen het toestemmingsformulier te lezen, in te vullen en te tekenen.
Nadat de proefpersoon het toestemmingsformulier heeft getekend, zullen we de
screening starten. Hiertoe zal de medische vragenlijst worden overlopen om zo
een algemeen beeld te krijgen van hun algemene gezondheid, gebruik van
medicatie en fysieke activiteit. De vrijwilligers zullen geïnstrueerd worden
over het juiste gebruik van de elleboogkrukken, dat men het geïmmobiliseerd
been niet mag belasten en de contractie van het geïmmobiliseerde been dient te
minimaliseren. Tevens zullen we lichaamsgewicht, lengte en bloeddruk bepalen.
De medische vragenlijst zal zorgvuldig doorgenomen worden door de
verantwoordelijke arts voordat de proefpersoon deel kan nemen aan het
onderzoek. Het screeningsbezoek zal ongeveer 1,5 uur in beslag nemen. Na de
screening zullen indien van toepassing (schriftelijke toestemming getekend en
toelaatbaar op basis van inclusie/exlusie criteria) de testdagen (Testdag #1,
#2 en #3) gepland worden. Er wordt getracht deze testdagen zo snel mogelijk in
te plannen, afhenkelijk van de beschikbaarheid van de proefpersonen. Echter,
proefpersonen dienen 3 dagen voorafgaand aan testdag #1 het voedingsdagboek in
te vullen en de Actical activiteitenmonitor te dragen, hiermee zal rekening
gehouden worden bij het inplannen van deze testdagen.

Dieet en activiteit voor de testdag
Alle proefpersonen zullen een standaard avondmaaltijd eten de avond voordat het
been wordt geïmmobiliseerd (Testdag #2). Tevens zullen de jonge proefpersonen
een standaard maaltijd eten de avond voor het onderzoek met de 13C6 aminozuur
tracer (Testdag #3). Deze standaard maaltijd is een *Aviko maaltijdpannetje* en
zal gekocht worden bij een supermarkt in Maastricht. De vervaldatum van de
fabrikant zal gecontroleerd worden. De maaltijden zullen tot die tijd
opgeslagen worden in een daarvoor bestemde vriezer in de keuken van de afdeling
humane biologie. De exacte samenstelling en bereiding zijn omschreven op het
label van de verpakking. Alle proefpersonen zullen ook gevraagd worden om hun
voedingsinname voor de 3 dagen direct voor immobilisatie en voor de 3 dagen
tijdens immobilisatie te noteren in een voedingsdagboek welke verstrek zal
worden tijdens de screening. Tevens zullen alle proefpersonen gevraagd worden
om een Actical fysieke activiteitenmonitor (Philips) te dragen en een
activiteitendagboek in te vullen om hun fysiek activiteitenpatroon voor de 3
dagen voorafgaand aan immobilisatie en de 3 dagen tijdens immobilisatie te
registreren. Tenslotte zullen alle proefpersonen geïnstrueerd worden om geen
zware fysieke inspanningen te verrichten en hun dieet zo constant mogelijk te
houden voor de 3 dagen voor en de 3 dagen tijdens immobilisatie.

Baseline Tests * (Testdag #1)
Voordat de immobilisatieperiode start zullen de proefpersonen enkele baseline
metingen ondergaan. Proefpersonen zullen om 07:30 in gevaste toestand (na 22.00
de vorige avond niks meer gegeten of gedronken te hebben, behalve water)
arriveren op het laboratorium. Een basale bloedafname en 3 speekselmonsters
zullen verzameld worden om de achtergrond verrijking van 2H in het plasma en
lichaamswater te bepalen. Proefpersonen zullen vervolgens beginnen gedeutereerd
water (deuterium oxide of 2H2O) te drinken volgens het volgende protocol:
Proefpseronen zullen 50mL van 70 APE verrijkt gedeutereerd water innemen op 8
verschillende momenten om: 0800, 0930, 1100, 1230, 1400, 1530, 1700 en 1830 om
een platteua in de verrijking van het lichaamswater te verkrijgen welke gelijk
is aan ~1-2%. De proefpersonen hoeven alleen op het laboratorium te blijven
voor de eerste 5 drankjes (0800, 0930, 1100, 1230, 1400); de overige kan men
thuis innemen (1530, 1700, 1830). Nadien dienen de proefpersonen iedere ochtend
(bij het opstaan) van de immobilisatie periode een 50mL dosis van 70 APE
verrijkt gedeutereerd water in te nemen, om zodoende de 1-2 APE verrijking in
lichaamswater te behouden. Tijdens dit bezoek zullen we ook de dwarsdoorsnede
van beide benen bepalen door middel van een CT scan, spiermassa van het gehele
lichaam bepalen d.m.v. MRI (magnetic resonance imaging), en
lichaamssamenstelling door middel van een DEXA (dual-energy X-ray
absorptiometry) scan. Tijdens de CT scan (IDT 8000; Philips Medical Systems,
Best, Netherlands) zal er een enkele scan gemaakt worden 15cm boven de basis
van de patella. Deze scan zal plaatsvinden in het Academische Ziekenhuis
Maastricht (Afdeling Radiologie) om zo de dwarsdoorsnede van de
bovenbeenspieren van beide benen te bepalen. Tijdens deze scan zullen de
proefpersonen op hun rug liggen, met hun benen gestrekt en voeten vastgemaakt,
dan zal er een 3mm dikke dwarsdoorsnede foto gemaakt worden. De scan
karakteristieken zullen als volgt zijn: 120kV, 300mA, rotatietijd van 0.75
seconden, en een zichtveld van 500mm. De exacte scan positie zal opgemoten en
gemarkeerd worden met een semi-permanente stift om deze te kunnen herhalen bij
de nametingen. Nadat de CT scan is gemaakt zullen de proefpersonen een MRI scan
ondergaan van het gehele lichaam. Dit door middel van een 3 T MR systeem
(Achieva 3Tx; Philips Healthcare); door gebruik te maken van een spoel welke
radiofrequenties uitzend en ontvangt. De ontvanger heeft een bandbreedte van
31.25 kHz. Door gebruik te maken van een turbo spin echo sequentie met een
proton *fliphoek* van 90 graden, zullen scans genomen worden op basis van
proton dichtheid. Hierdoor zal een afbeelding gecreëerd worden welke de
protondichtheid van elk type weefsel karakteriseert. De afbeeldingen zullen
genomen worden door gebruik te maken van een matrix met 320-512 pixels en een
55cm gezichtsveld. Er zullen continue afbeeldingen van 10mm dikte worden
gemaakt zonder dat er gebieden worden overgeslagen. Deze afbeeldingen zullen
genomen worden in vier tot zes sequenties van 38-40 afbeeldingen voor
specifieke lichaamsregio*s van elke deelnemer. een DEXA scan ondergaan op de
universiteit. Hiervoor zullen de proefpersonen gevraagd worden om met hun rug
op de scantafel te gaan liggen en gedurende de scan (3 minuten) niet te
bewegen. Deze hierboven genoemde metingen stellen ons in staat om de
dwarsdoorsnede van de bovenbeenspieren van beide bovenbenen te bepalen evenals
de lichaamssamenstelling van de proefpersonen. In geval van een medische
toevalsbevinding zullen we de proefpersoon en zijn huisarts informeren. Indien
de proefpersonen deze informatie niet willen ontvangen, kan hij/zij niet
deelnemen aan het onderzoek. Dit bezoek zal ongeveer 6,5 uur duren.

Begin van immobilisatie * (Testdag #2)
De dag na Bezoek #1 zullen de proefpersonen om 07:30 in gevaste toestand (niks
meer gegeten of gedronken te hebben (behalve water) na de standaard
avondmaaltijd, welke niet later dan 22.00 is gegeten) op het laboratorium
arriveren. Proefpersonen zullen eerst gevraagd worden voor een speekselmonster,
daarna zal er een bloedafname plaatsvinden en ten slotte een enkel spierbiopt
worden afgenomen van de m. vastus lateralis van een been om zo de 2H verrijking
van de spiereiwitten direct voor immobilisatie te bepalen. Dit biopt zal
afkomstig zijn van het been dat niet geimmobiliseerd wordt. Het spierbiopt zal
afgenomen worden van de middelste regio van de m. vastus lateralis (15cm boven
de patella en ongeveer 2 cm van het fascia) met behulp van de percutane
naaldbiopsie techniek. Zichtbaar niet-spierweefsel zal voorzichtig verwijderd
worden van het biopt en vervolgens zal het biopt ingevroren worden met
vloeibaar stikstof. Nadien worden die spierbiopten opgeslagen bij -80°C tot
verdere analyse. Randomizatie zal bepalen welk been geimobiliseerd wordt. Na
het biopt, zal het andere been geimmobilisseerd worden door het in te gipsen
vand 10cm boven de enkel tot halverwegen het bovenbeen met een kniehoek van 30
graden. Het gips zal er voor 3 dagen op blijven zitten. Daarna zal de
vrijwilliger geinstrueerd worden hoe hij/zij de elleboogkrukken moet gebruiken,
dat het geimmobiliseerd been niet belast mag worden en om spiercontracties van
het bovenbeen tot een minimum beperkt moeten worden. Dit protocol is voorheen
al met succes gebruikt in immobilisatie studies (METC 09-3-011, METC 11-3-073,
METC 12-3-012, METC 12-3-063, METC 13-3-023). Door een been in te gipsen kan er
zowel naar het geïmmobiliseerde als het niet-geïmmobiliseerde been binnen een
persoon gekeken worden en dient iedere proefpersoon als zijn eigen interne
controle. Nadat het been is ingegipst, zal de proefpersoon per taxi of auto
naar huis worden gebracht. Dit bezoek zal ongeveer 2 uur duren.

Tijdens immobilisatie
Tijdens de 3 dagen van immobilisatie zal een van de leden van het
onderzoeksteam regelmatig contact opnemen met de proefpersoon. Op deze momenten
kunnen vragen of onduidelijkheden van de proefpersonen beantwoord worden en kan
er gecontroleerd worden of men zich aan het protocol houd. Alle proefpersonen
kunnen ten alle tijden contact opnemen met de onderzoeker en/of arts om
eventuele vragen of problemen gerelateerd aan de immobilisatie of deelname aan
de studie te bespreken.
Tijdens de immobilisatieperiode zullen de proefpersonen doorgaan met het
innemen van 2H2O (50mL 1x 50mL per dag in de ochtend) om zo de verrijking in
het lichaamswater op peil te houden en ook zal men een speekselmonster
verzamelen (in de avond). Hiertoe worden de proefpersonen voorzien met plastic
salivette flacons welke katoenen watjes bevatten om het speeksel te verzamelen.
De proefpersoon zal gevraagd worden om op het katoenen watje te kauwen vooe
30-60 seconden, totdat het watje verzadigd is met speeksel. Daarna zullen ze
het watje terug plaatsen in de salivette flacon, het opslaan in hun vriezer en
voor het volgende bezoek meenemen naar de universiteit. Tijdens immobilisatie
zullen proefpersonen een leucine of koolhydraat (maltodextrine) supplement
innemen (dubbel-blind) bij elke maaltijd (ontbijt, lunch, avondeten). Tijdens
elk van deze momenten dient men 5.0g leucine of koolhydraten in te nemen
(totaal 15g per dag).

Einde van immobilisatie * Testdag #3
Oudere Proefpersonen
In de ochtend, na 3 dagen (of 72 uur) immobilisatie, zullen de proefpersonen
naar de universiteit komen voor het laatste bezoek. Allereerst zal het gips
verwijderd worden, echter het is niet toegestaan dat de deelnemer het voorheen
geïmmobiliseerde been belast. Daartoe worden de proefpersonen per rolstoel naar
de CT scanner gebracht waar er een CT scan gemaakt wordt zoals hierboven
beschreven. Daarna zullen de proefpersonen per rolstoel naar het laboratorium
worden gebracht waar er 2 spierbiopten worden afgenomen; een van het
geïmmobiliseerde been en een van het andere been. Het biopt van het
geïmmobiliseerde been zal dus worden afgenomen terwijl het been nog steeds niet
belast is (dus de spieren hebben nog geen gewicht gedragen). Met de twee
biopten zal de cumulatieve (3 daagse) spiereiwitsynthese snelheid in beide
benen (geïmmobiliseerd en niet geïmmobiliseerd) bepaald kunnen worden op basis
van de verandering in de verrijking van het spiereiwit gebonden 2H bepaald in
het spierbiopt van voor de immobilisatie. Ook zullen er bloed en speeksel
monsters afgenomen worden om de 2H verrijking in het plasma en lichaamswater te
bepalen. In totaal zullen de oudere proefpersonen 3 spierbiopten ondergaan en
zullen er 3 bloed samples worden afgenomen (3x8mL = 24mL in totaal). Dit bezoek
zal ongeveer 2 uur duren.
Jonge proefpersonen
In de ochtend, na 3 dagen (of 72 uur) immobilisatie, zullen de proefpersonen
naar de universiteit komen voor het laatste bezoek. Allereerst zal het gips
verwijderd worden, echter het is niet toegestaan dat de deelnemer het voorheen
geïmmobiliseerde been belast. Daartoe worden de proefpersonen per rolstoel naar
de CT scanner gebracht waar er een CT scan gemaakt wordt zoals hierboven
beschreven. Daarna zullen de proefpersonen per rolstoel naar het laboratorium
worden gebracht waar men een geprimed constant infuus van L-[ring-13C6]
phenylalanine zal ondergaan voor 5 uur. 2 uur na de start van het infuus zal
er bij de proefpersoon 2 spierbiopten worden afgenomen; een van het
geïmmobiliseerde been en een van het andere been. Het biopt van het
geïmmobiliseerde been zal dus worden afgenomen terwijl het been nog steeds niet
belast is (dus de spieren hebben nog geen gewicht gedragen). Met de twee
biopten zal de cumulatieve (3 daagse) spiereiwitsynthese snelheid in beide
benen (geïmmobiliseerd en niet geïmmobiliseerd) bepaald kunnen worden op basis
van de verandering in de verrijking van het spiereiwit gebonden 2H bepaald in
het spierbiopt van voor de immobilisatie. Ook zullen er bloed en speeksel
monsters afgenomen worden om de 2H verrijking in het plasma en lichaamswater te
bepalen. Voor de groep met jongere proefpersonen zullen deze biopten ook
gebruikt worden om de waarden van intracellulair vrij en eiwitgebonden
L-[ring-13C6] phenylalanine en de baseline 3,3-D2 phenylalanine verrijking te
meten in de spier en om zodoende spiereiwitafbraak te bepalen door gebruik te
maken van de *tracee-release* methode. Meteen na deze twee biopten zullen de
proefpersonen een geprimde *continue infusie van 3,3-D2 phenylalanine ondergaan
voor 2 uur. Daarna zal het 3,3-D2 phenylalanine infuus gestopt worden om het
verval in 3,3-D2 phenylalanine in het bloed en de spier (intracellulair vrij en
amino zuur pool) te bepalen. Hiertoe zullen 40 min na dat het 3,3-D2
phenylalanine infuus gestopt is een 2de set biopten worden afgenomen van elk
been om de intracellulair vrije en protein gebonden L-[ring-13C6] phenylalanine
en 3,3-D2 phenylalanine verrijking te meten in de spier. 60 minuten na het
stoppen van het 3,3-D2 phenylalanine infuus zullen de laatste 2 biopten
afgenomen worden, wederom van ieder been een. Dit om de verdunning in de
verrijking van intracellulair vrij 3,3-D2 phenylalanine en de verrijking van
L-[ring-13C6] phenylalanine te bepalen. Bloedsamples zullen tijdens de eerste 4
uur om het uur worden afgenomen om de verrijking van L-[ring-13C6]
phenylalanine en 3,3/D2 phenylalanine in het bloedplasma te meten. Tijdens de
periode waarin het verval in de verrijking van 3,3/D2/phenylalanine wordt
bepaald wordt er tijdens het laatste uur om de 10 minuten bloed afgenomen om de
3,3-D2 verrijking in het bloed te bepalen. In totaal zullen er bij de jongere
proefpersonen 7 biopten en 13 bloedsamples (13x8mL = 104mL totaal) worden
afgenomen. Hierbij dient het 2de bloedsample in de 72 uur immobilisatie periode
ook als het eerste bloedsample in de acute trail. Dit bezoek zal ongeveer 7 uur
duren.

3 dagen immobilisatie door het ingipsen van een been Een been zal voor 3 dagen geïmmobiliseerd worden onder een kniehoek van 30 graden flexie door middel van ingipsen. Het been te immobiliseren been wordt toegewezen door randomisatie waarbij er een gelijk aantal links en rechts worden geïmmobiliseerd. Doordat slechts 1 gewricht geimobiliseerd wordt, is het niet nodig profylactische medicatie (om trombose te voorkomen) te gebruiken. Echter om het risico op trombose nog verder te verminderen zullen alle proefpersonen dagelijks oefeningen moeten uitvoeren om zo de >kuitspierpomp> te activeren. De tijd die nodig is om deze oefeningen uit te voeren is 5 minuten. De oefeningen zullen 3 keer per dag (ochtend, middag en avond) worden uitgevoerd gedurende de 3 dagen immobilisatie. Proefpersonen zullen elleboogkrukken mee naar huis krijgen omdat het niet toegestaan is om get geïmmobiliseerde been te belasten. De proefpersonen zullen geïnstrueerd worden over het juist gebruik van de elleboogkrukken. Ondanks deze instructies, zullen de proefpersonen hoogst waarschijnlijk in grote mate fysiek beperkt zijn. Activiteiten zoals het besturen van een auto en of fiets en sporten zullen niet mogelijk zijn. Voor andere activiteiten zoals reizen en trappen lopen heeft men mogelijk assistentie nodig. Het is alleen toegestaan om te lopen met de krukken, zonder het geïmmobiliseerde been te belasten. In het algemeen is het belangrijk te vermelden dat gedurende de immobilisatie periode de proefpersonen sterk beperkt zullen zijn in hun fysieke mobiliteit. Nadat het gips is verwijderd is het mogelijk dat men enkele effecten van een afname in spiermassa en kracht ervaart in hun geïmmobiliseerd been. De normale mobiliteit en alledaagse activiteiten zullen niet langer beperkt zijn, echter kan de sportprestatie verminderd zijn voor 2-14 dagen. Tijdens de immobilisatie- en herstelperiode zal de onderzoeker regelmatig contact hebben met de deelnemer om zodoende vragen of problemen te beantwoorden. Tijdens de herstelperiode hebben de proefpersonen ten alle tijden de mogelijkheid om contact te zoeken met de onderzoeker en arts om eventuele problemen gerelateerd aan de immobilisatieperiode te bespreken. Aangezien de korte herstelperiode (3 dagen), verwachten we dat de spiermassa en functie vanzelf zullen herstellen binnen een aantal weken nadat het gips is verwijderd. Leucine Tijdens de immobilisatie periode zullen de proefpersonen flesjes ontvangen welke 5g leucine of koolhydraten (maltodextrine) bevatten (dubbel-blind). De proefpersonen dienen deze supplementen in te nemen bij elke maaltijd (ontbijt, lunch, avondmaaltijd) voor een totaal van 15g (3 flesjes) per dag.

De risico*s die gepaard gaan met deelname aan dit onderzoek zijn minimaal.
Indien een proefpersoon geïnteresseerd is, krijgt hij/zij zijn individuele
resultaten toegestuurd. De proefpersonen zullen een vergoeding krijgen voor hun
tijdsivestering en de lasten van de studie. Daarnaast zijn er geen bijkomstige
voordelen verbonden aan deelname in dit onderzoek.
De insisie die gemaakt wordt voor het afnemen van het spierbiopt zal onder
lokale verdoving plaatsvinden en uitgevoerd worden door een ervaren arts.
Binnen onze onderzoeksgroep hebben we veel ervaring met het afnemen van
spierbiopten. Er is een kleine kans op infectie en het spierbiopt kan leiden
tot een klein hematoom. Tijdens de bloedafname is er een klein risico op
flauwvallen of een hematoom. Deze risico*s worden geminimaliseerd doordat de
onderzoekers getraind en ervaren zijn in het afnemen van spierbiopten en bloed.
Na de bloedafname en het spierbiopt zal er gepaste druk worden uitgeoefend om
zo het risico op een hematoom te verminderen.
De Aviko maaltijd bevat normale voedingsproducten en is geschikt voor
consumptie. Er zijn geen complicaties geassocieerd met het uitvoeren van een CT
scan. De straling die hierbij vrijkomt is erg laag en bedraagt ongeveer 0,053
mSv per scan. Tijdens deze studie zullen de proefpersonen 2 CT scans ondergaan
(voor en na de immobilisatie periode) en zullen daardoor blootgesteld worden
aan 0,106 mSv. Deze scan worden routinematig uitgevoerd bij studies van onze
groep (zie bijv. MEC 06-3-062, 11-3-073, 12-3-012). De DEXA scan zal gebruikt
worden om de lichaamssamenstelling te bepalen. Proefpersonen zullen hierdoor
blootgesteld worden aan 0,001 mSv. Ter vergelijking, wordt men in Nederland per
jaar blootgesteld aan ~2.5 mSv aan achtergrondstraling. De MRI scan is niet
invasief, echter kan men zich door het geluid van de scanner en het feit dat
men op een "tafel/bed" in een kleine "tunnel" ligt als onprettig worden ervaren.
Met Betrekking tot de tijdsinvestering dienen de proefpersonen de universiteit
te bezoeken voor een screening (Bezoek #1) welke ongeveer 1,5 uur zal duren.
Daarnaast zal de dag waarop de baseline metingen worden uitgevoerd (Bezoek #2)
ongeveer 2 uur duren. De dag dat het been wordt ingegipst zal ongeveer 2 uur
duren. Als laatste zal het laatste bezoek (#4) ongeveer 2 uur duren voor de
ouderen en ongeveer 7 uur voor de jongere proefpersonen. Daarnaast zullen de
proefpersonen gevraagd worden om voor in totaal 6 dagen (3 voor en 3 tijdens
immobilisatie) een voedings- en activiteitendagboek in te vullen. Echter de 3
dagen immobilisatie van het been zal het grootste ongemak ten aanzien van tijd
en mobiliteit zijn. Een been zal voor 3 dagen geïmmobiliseerd worden door het
in te gipsen onder een kniehoek van 30 graden flexie. In een gezonde populatie
zal trombose zich ontwikkelen in 1 op de 1000 individuen per jaar. Na een
operatie of bot fractuur zal immobilisatie van 2 of meer gewrichten het risico
op trombose verhogen. Het voorkomen van trombose door immobilisatie als gevolg
van een operatie en/of botfractuur wordt geschat tussen de ~0.2 en ~17%.
Echter, in de huidige studie is profylactische medicatie om trombose te
voorkomen niet nodig aangezien slechts 1 gewricht wordt geïmmobiliseerd voor
een periode van slechts 3 dagen. Echter om het risico op trombose nog verder te
verminderen zullen alle proefpersonen met een geschiedenis van trombose worden
geexcludeerd en zal men dagelijks oefeningen moeten uitvoeren om zo de
*kuitspierpomp* te activeren. De tijd die nodig is om deze oefeningen uit te
voeren is 5 minuten. De oefeningen zullen 3 keer per dag (ochtend, middag en
avond) worden uitgevoerd gedurende de 3 dagen immobilisatie. Ten slotte zullen
de proefpersonen tijdens de immobilisatie goed gemonitord worden door het
onderzoeksteam, welke regelmatig contact zullen opnemen met de proefpersonen om
tekenen van tromboseontwikkeling te identificeren en indien nodig hierna te
handelen. Dus, tijdens deze studie het risico op trombose minimaal (<0,1%). Het
ingegipste been zal voor veel fysieke hinder zorgen. Aangezien de proefpersonen
het geïmmobiliseerde been niet mogen belasten word men voorzien van
elleboogkrukken. Volledige instructie over het correct gebruik hiervan worden
verleend. Om het risico op blessures door dit verlies in mobiliteit te
beperken, zal men activiteiten als autorijden, fietsen en sporten niet mogen
uitvoeren gedurende de 3 dagen dat het been geïmmobiliseerd is. Voor andere
activiteiten (reizen, traplopen) kan men assistentie nodig hebben. Lopen is
alleen toegestaan met de elleboogkrukken, zonder het geïmmobiliseerde been te
belasten. Tijdens de eerste dagen/week nadat het gips is verwijderd kan men de
effecten van een vermindering in spiermassa en *kracht ondervinden in het
voorheen geïmmobiliseerde been. De normale mobiliteit en alledaagse
activiteiten zullen niet langer beperkt zijn, echter kan de sportprestatie iets
minder zijn in de eerste week na de studie. Echter, sinds alleen gezonde
proefpersonen zullen deelnemen aan deze studie, zal de spierfunctie zich
hoogstwaarschijnlijk volledig zelfstandig herstellen binnen een aantal weken
nadat het gips is verwijderd. Het is inderdaad aangetoond dat zelfs na 3 weken
immobilisatie van een been in jonge individuen het terug oppakken van spontane
activiteiten voor 2 weken resulteert in een 90% herstel van de spierkracht en
95% herstel van spiervezelgrote. 6 weken nadat het gips is verwijderd zullen de
proefpersonen voor een laatste keer gecontacteerd worden (via telefoon of
e-mail) om na te gaan of men volledig is hersteld. Indien dit niet het geval
is, zal er een trainingsschema worden opgesteld of zal men worden doorgestuurd
naar de huisarts indien nodig.
Zoals hierboven beschreven is het leucine supplement algemeen geaccepteerd voor
wetenschappelijke en klinische doeleinden. Geen grote risico*s zijn
geassocieerd met het gebruik van leucine in gezonde proefpersonen, zelfs voor
langere perioden of wanneer gebruikt in concentraties hoger dan welke gebruikt
worden in deze studie.