NET formatie door neutrofielen

NETs, die gevormd worden een proces wat NETose genoemd wordt, zijn het nieuwst
beschreven wapen in het arsenaal van neutrofielen om pathogenen te bestrijden.
Tijdens het proces van NETose schiet de neutrofiel zijn chromatine de cel uit.
Aan dit web van chromatine zitten allerlei antibacteriele eiwitten en op die
manier werkt het als een plakkerig netwerk waar ziekteverwekkers in kunnen
worden gevangen. Deze zogenaamde Neutrophil Extracellular Traps (NETs)
voorkomen daarmee ook dat de ziekteverwekkers zich verder door het lichaam
kunnen verspreiden en ze kunnen makkelijker door het immuunsysteem worden
opgeruimd. NET formatie is voor het eerst beschreven in 2004 en vanaf dat
moment zijn er veel studies gestart om achter het moleculaire mechanisme van
NET formatie te komen, maar helaas zijn er nog steeds veel onbeantwoorde
vragen. Met deze studie willen we bijdragen aan dit onderzoek en een beter
fundamenteel inzicht krijgen in NETose en NET formatie.

NETose is gemakkelijk te bestuderen in in vitro experimenten met (humane)
neutrofielen die uit vers gedoneerd bloed van gezonde personen zijn geisoleerd.
Deze geisoleerde neutrofielen worden dan gezaaid in plastic well-platen of
petrischaaltjes en daarna gestimuleerd met verschillende stoffen die NET
formatie induceren. In de literatuur zijn inmiddels verschillende van die
stimuli beschreven, maar niet iedereen gebruikt dezelfde stimuli en daarom is
het lastig om de reeds bestaande data van verschillende onderzoeksgroepen over
NET formatie met elkaar te vergelijken. Daarnaast is het ook nog eens zo dat de
verschillende stimuli via verschillende mechanismes voor NET formatie zorgen en
daarom niet eens met elkaar vergeleken kunnen worden. Wij hopen met ons
onderzoek meer te weten te komen over de verschillende mechanismes die leiden
tot NET formatie.

Deze karakterisatie is klinisch relevant omdat de NETs in veel verschillende
ziektebeelden zijn geassocieerd sinds de eerste beschrijving van NETose in
2004. Men had al snel het idee dat het DNA en de andere (eiwit) componenten die
vrijkomen bij NETose, een autoimmuunreactie zouden kunnen opwekken als ze niet
goed door het lichaam worden opgeruimd. Daarom hebben veel vervolgonderzoeken
gekeken naar de invloed van de NETs op autoimmuunziekten zoals systemische
lupus erythematosus (SLE) en reumatoide arthritis (RA). Naast het risico op
autoimmuunziektes kunnen de antimicrobiele eiwitten op de NETs ook schadelijk
zijn voor naburig weefsel. Tot slot is recent aangetoond dat NETs ook
bloedvaten kunnen verstoppen en stollingen kunnen veroorzaken, waardoor NETs nu
ook worden geassocieerd met thrombotische ziektes. Een beter fundamenteel
inzicht hoe NETs nu eigenlijk gevormd worden, kan helpen in de ontwikkeling van
behandelingen voor de bovengenoemde ziektes. Medicijnen die NET formatie
kunnen tegengaan, of de gevormde NETs snel kunnen afbreken kunnen bijvoorbeeld
voorkomen dat bloedvaten verstopt raken of dat weefsels aangedaan raken. De
balans is hierbij belangrijk, want de NETs blijven natuurlijk ook belangrijk
voor het afweersysteem.

Het doel van deze studie is het verkrijgen van een beter fundamenteel inzicht
in NET formatie door neutrofielen en de moleculaire mechanismen die aan dit
proces ten grondslag liggen. We hopen meer te weten te komen over:
* De verschillen in NET formatie na het bloodstellen van de neutrofielen aan
verschillende stimuli.
* De betrokkenheid van eiwit-modificerende enzymen in het proces van NET
formatie.
* De hoeveelheid gecitrulineerde eiwitten in NETs
* De intracellulaire calcium en ROS levels in neutrofielen die NETose
ondergaan.

Deze studie is gebaseerd op het isoleren van neutrofielen uit bloed wat
gedoneerd is door gezonde vrijwilligers. De geisoleerder neutrofielen worden
gebruikt om het proces van NET formatie te kunnen bestuderen in in vitro
experimenten. Bloed monsters zullen worden verkregen via venapunctie nadat de
proefpersoon het toestemmingsformulier heeft getekend. Per donatie wordt er 10
tot 40 ml bloed opgevangen, de exacte hoeveelheid hangt af van het geplande
experiment en de donor zal op de hoogte worden gebracht van de hoeveelheid die
hij geacht wordt te doneren. De donoren worden niet in de tijd gevolgd en ook
niet aan andere handelingen bloot gesteld behalve het doneren van bloed.
Daarnaast willen we benadrukken dat dit onderzoek geen resultaten gaan
opleveren die klinisch relevant zijn voor de donor, aangezien we niks meer over
de donor te weten komen dan de hoeveelheid bloedcellen die de donor heeft. Deze
hoeveelheid bloedcellen verschilt enorm tussen individuen en daarom zijn daar
geen klinische conclusies aan te verbinden.

Wij hebben voor deze proefopzet gekozen vanwege het feit dat neutrofielen
slechts een dag leven. Hierdoor zijn de zogenaamde buffy-coats van Sanquin
ongeschikt, omdat deze producten meestal een nacht bewaard worden. Daarnaast
hebben wij slechts kleine hoeveelheden nodig om de experimenten uit te voeren
en zouden we ruim 90% van de buffy-coat verspillen. Voor de meest betrouwbare
NET experimenten is het belangrijk dat het bloed vers is en daarom kiezen wij
voor het vers doneren van bloed. Na het ondertekenen van het
toestemmingsformulier betekent dit een donatie van 10 tot 40 ml bloed in EDTA
buizen. Deze venapunctie zal worden uitgevoerd door verpleegkundigen van de
afdeling neurologie in het RadboudUMC. Neutrofielen zullen vervolgens worden
geisoleerd via standaard procedures en vervolgens worden er (diezelfde dag nog)
in vitro experimenten mee uitgevoerd. Als deze experimenten zijn uitgevoerd
worden alle materialen vernietigd, geen van de materialen die van de donor
afkomstig zijn zullen worden opgeslagen.

Risico en belasting: De risico's zijn verwaarloosbaar en de belasting is
minimaal. De meest voorkomende risico's die behoren bij het doneren van bloed
zijn het ongemak van de prik. Daarnaast kan het voorkomen dat de prikwond
blijft bloeden of dat de donor flauw valt, maar beiden zijn onwaarschijnlijk.
Voordelen: Er zijn geen directe voordelen voor de donor behalve het bijdragen
aan wetenschappelijk onderzoek.