Effect van opslagduur en opslagmedium op post-transfusie klaring en metabool herstel van rode bloedcellen

Transfusies van rode bloedccellen (RBCs) worden frequent toegediend aan
patiënten die een toename van zuurstof transporterende capaciteit nodig hebben.
In de meeste landen mogen RBCs maximaal 35-42 dagen opgeslagen worden omdat de
transfusieproducten gedurende opslag veranderingen ondergaan die de "opslag
laesie" worden genoemd. Deze "opslag laesie" omvat een achteruitgang van de
kwaliteit van het transfusieproduct waarbij de RBC versiculeert, membraan
verliest, lyseert, de concentraties glutathione, 2,3-difosfoglyceraat
(2,3-DPG), adenosine trifosfaat (ATP) en stikstofoxide omlaag gaan, de membraan
CD47 tot expressie gaat brengen, en er toegenomen oxidatie van lipiden en
eiwitten ontstaat. Dit alles leidt tot een opslagduurafhankelijke afname in pH,
toename van kalium en verlies van hemoglobine. Deze processen verminderen de
post-transfusie overleving en functie van RBCs. De Amerikaanse Voedsel en
Warenautoriteiten (FDA) heeft als voorwaarden dat RBC transfusies aan minimum
kwaliteitseisen moeten voldoen voordat de nieuwe rode bloedcelproducten worden
goedgekeurd voor humaan gebruik. Zo moet in minimaal 20 gezonde proefpersonen
tenminste 75% van de getransfundeerde RBCs minimaal 24 uur na transfusie nog in
de circulatie te vinden zijn.

Verschillende studies echter hebben laten zien dat 24 uur na transfusie <75%
van de getransfundeerde rode bloedcellen nog in de circulatie aanwezig is. Het
is onduidelijk welke eigenschappen van het bloedproduct en welke processen in
het lichaam deze klaring veroorzaken, maar de opslagduur van bloedproducten
speelt hier waarschijnlijk een rol in. Als RBCs verouderen brengen zij meer
"eet-mij-op" signalen tot expressie, zoals bijvoorbeeld phosphatidylserine
(PS); in een rattenmodel bleken oudere RBCs bovendien aan de vaatwand te
plakken doordat ze van vorm veranderden; de RBC vervormbaarheid neemt of
tijdens opslag en belemmert de microcirculatie en de opbrengst van RBCs is
lager vergeleken met jongere RBCs. In een eerder gepubliceerd onderzoek was de
gemiddelde opbrengst van een RBC transfusie 24 uur na transfusie 86.4% in
hematologiepatiënten voor RBCs die <10 dagen waren opgeslagen en 73.5% voor
RBCs die langer dan 21 dagen waren opgeslagen.

In de afgelopen 10 jaar is enorm veel onderzoek gedaan naar de "opslag laesie"
van RBCs. Observationele studies hebben laten zien dat er een relatie is tussen
de opslagduur van RBCs en mortaliteit in de ontvangers van deze producten.
Recent zijn er echter verschillende RCTs gepubliceerd waaruit bleek dat
standaard tijd opgeslagen RBCs (mediaan van 21 dagen) geen toename van
mortaliteit of morbiteit gaf, vergeleken met RBCs die <8 dagen waren
opgeslagen. Een belangrijke beperking van deze studies is echter wel dat hierin
de standaard opslagduur werd onderzocht en niet de maximale opslagduur.
Daarnaast is bekend dat de kwaliteit van het bloedcelproduct achteruit gaat
gedurende opslag wat vanuit het perspectief van zowel de bloedbank en de
patiënt onwenselijk is.

In de afgelopen 10 jaar is ook onderzoek gedaan naar nieuwe bewaarvloeitstoffen
voor RBCs. Er zijn verschillende alkalische, chloride-vrije bewaarvloeistoffen
ontwikkeld die allen gebaseerd zijn op het werk van Meryman en collega's. Deze
vloeistoffen hebben wel allemaal een andere samenstelling. In vitro geven deze
bewaarvloeistoffen (AS-7, E-Sol, PAGGGM) verschillende "opslag laesies". PAGGGM
is door Sanquin ontwikkeld en geeft de minste hemolyse na 35 dagen opslagduur
met de hoogste 2,3-DPG en ATP. AS-7 (ook wel bekend als SOL-X) is in de VS al
voor opslag van RBCs goedgekeurd. E-SOL en PAGGGM zijn voor onderzoek
beschikbaar. Voor AS-7 en PAGGGM zijn er al resultaten van metabolomics studies
gepubliceerd, maar deze resultaten zijn niet bevestigd met enzymactiviteit
tests. Daarnaast is er ook nog niet bekend hoe het metabolisme van RBCs
herstelt na transfusie voor zowel de klassieke bewaarvloeistoffen (SAGM) als de
nieuwe vloeistoffen. Inzicht in het ontstaan van de "opslag laesie" kan de
ontwikkeling van verbeterde opslagtechnieken en bewaarvloeistoffen stimuleren.
Dit geeft op zijn beurt een verhoogde productkwaliteit met minder bijwerkingen
van bloedtransfusie, met daarnaast mogelijk ook een langere maximale
bewaarduur.

De opbrengst van RBCs en metabool herstel na transfusie kan onderzocht worden
door RBCs te labelen met biotine (vitamine B8) en vervolgens aan mensen toe te
dienen. Deze methode is zonder nadelige gevolgen reeds verschillende malen in
mensen toegepast, waaronder in een studie door onze onderzoeksgroep in het AMC.
Biotinelabeling maakt het ook mogelijk om verschillende populaties RBCs van
elkaar te scheiden door deze met verschillende concentraties biotine te
labellen.

In deze studie zullen wij in een gezonde vrijwilligers transfusiemodel biotine
gelabelde RBCs gebruiken om de volgende condities te onderzoeken: 1) het effect
van de in Nederland maximale toegestane opslagduur van RBCs op het metabole
herstel en de opbrengst van getransfundeerde RBCs en 2) het effect van
verschillende RBC bewaarvloeistoffen op het metabole herstel en de opbrengst
van getransfundeerde rode bloedcellen.

Een humaan gezonde vrijwilligers transfusiemodel heeft de volgende voordelen:
1) een autoloog transfusiemodel maakt het mogelijk om de invloed van
opslagduur op de opbrengst van RBCs te onderzoeken, zonder inmenging van
allogene factoren;
1) een autoloog transfsuiemodel waarin vrijwilligers tegelijkertijd 2 dagen en
35 dagen oud bloed toegediend krijgen, verhoogte de power van de studie doordat
vrijwilligers als hun eigen controle fungeren en voorkomt confounding door
gebruik van twee groepen.
3) biotinelabeling maakt het mogelijk zeer gedetailleerde klarignsstudies te
doen, en maakt het mogelijk om getransfundeerde rode bloedcellen weer uit de
circulatie te isoleren. Hierdoor kunnen er extra assays gedaan worden om de
kwaliteit van de cel na transfusie te onderzoeken.

1) Vergelijken van post-transfusie opbrengst van verse en opgeslagen RBCs.
Van deze cellen zal onderzocht worden of de glycolyse, pentose fosfaat pathway
en metabole activiteit herstellen na transfusie. Dit zal met enzymassays en
metabolomics onderzocht worden.
2) Vergelijken of de glycolyse, pentose fosfaat pathway en metabole
activiteit beter behouden is tijdens opslag van RBCs in PAGGGM of een
vergelijkbare alkalische bewaarvloeistof, vergeleken met standaard opslag in
SAGM.
3) Vergelijken of de glycolyse, pentose fosfaat pathway en metabole
activiteit beter herstellen na transfusie na opslag in PAGGGM of een
vergelijkbare alkalische bewaarvloeistof, vergeleken met standaard opslag in
SAGM.

Studietype: open label gerandomiseerde interventie trial.
Proefpersonen: gezonde vrijwilligers.

Methode:

Screening en donatie van RBCs:
Alle vrijwilligers ondergaan eerst een screening (medische voorgeschiedenis,
lichamelijk onderzoek, ECG, bloed- en urineonderzoek) door de onderzoeksarts
van het AMC. Daarnaast moeten de vrijwilligers voldoen aan de voorwaarden voor
bloeddonatie van Sanquin voordat ze in de studie geïncludeerd kunnen worden.
Twintig gezonde vrijwilligers, tussen de 18-35 jaar oud, zullen in 1 van de
groepen gerandomiseerd worden. Zij zullen 35 dagen voor de studiedag een
standaard volbloed donatie doen bij Sanquin. Een tweede donatie van 200 ml
volgt 2 dagen voor de studiedag. Dit product zal met een volbloed leukodepletie
filter behandeld worden om een transfusieproduct te maken. De bloedafnames
tijdens de screening en tijdens de 2 donaties zullen overeenkomen met een
totaal van ongeveer 735 ml in 35 dagen. Dit is gelijk aan ongeveer 15% van het
circulerende volume van een man van 175 cm. Dit volume is de maximale
toegestane hoeveelheid die volgens de richtlijnen van Sanquin Bloed Bank
gedoneerd mag worden binnen de studieperiode. Daarnaast krijgen de
vrijwilligers de studiedag het grootste gedeelte van het gedoneerde bloed weer
terug via de transfusie. De fabricage van de producten en de opslag zullen
volgens Sanquin standaarden zijn. Elke week worden de producten gemonsterd met
een steriel afnamesysteem. Deze monsters worden bewaard tot analyse.

Randomisatie groepen:
Group 1a: Standaard RBCs in SAGM - 2 dagen opgeslagen RBCs worden gelabeld met
een hoge concentratie biotine, 35 dagen opgeslagen RBCs worden gelabeld met een
lage concentratie biotine.
Group 1b: Standaard RBCs in SAGM - 2 dagen opgeslagen RBCs worden gelabeld met
een lage concentratie biotine, 35 dagen opgeslagen RBCs worden gelabeld met een
hoge concentratie biotine.
Group 2a: RBCs opgeslagen in alkaline bewaarvloeistof - 2 dagen opgeslagen RBCs
worden gelabeld met een hoge concentratie biotine, 35 dagen opgeslagen RBCs
worden gelabeld met een lage concentratie biotine.
Group 2b: RBCs opgeslagen in alkaline bewaarvloeistof - 2 dagen opgeslagen RBCs
worden gelabeld met een lage concentratie biotine, 35 dagen opgeslagen RBCs
worden gelabeld met een hoge concentratie biotine.

Studiedag:
Voor aanvang de studiedag worden de 2 dagen opgeslagen (vers) en 35 dagen
opgeslagen (opgeslagen), gelabeld met twee verschillende concentraties biotine
(vitamine B8). Om uit te sluiten dat de concentratie biotine waarmee de cellen
gelabeld worden van invloed is, wordt de helft van de verse producten met een
lage concentratie biotine gelabeld en de oude producten met een hoge
concentratie. Bij de andere helft worden de verse producten met een hoge
concentratie biotine gelabeld en de oude producten juist met een lage
concentratie. De productie en labeling wordt onder steriele omstandigheden
gedaan. De bloedproducten worden gekweekt om de steriliteit te bevestigen. Na
transfusie worden veneuze samples afgenomen waarin de gelabelde RBCs
gedetecteerd kunnen worden door ze te kleuren met streptavidine-FITC en te
analyseren met flow cytometrie (FACS).
Op de studiedag zullen de vrijwilligers eerst een infusie van indiocyanine
groen krijgen. Deze gift is nodig om het circulerend volume te bepalen zodat
vast gesteld kan worden of er in de eerste minuten na infusie al klaring is van
getransfundeerde RBCs. Nadat de samples afgenomen zijn om het circulerend
volume vast te stellen, zullen de vrijwilligers een transfusie krijgen van de
autologe transfusieproducten. Bloed wordt vlak voor de indocyanine groen
infusie, 5, 10 en 20 minuten na indocyanine groen infusie, voor transfusie en
10 minuten, 0.5, 1, 2, 4, 6 en 8 uur na transfusie afgenomen. De vrijwilligers
komen 24 uur na transfusie en 2, 7, 30 en 90 dagen na transfusie terug voor
follow-up samples. In totaal wordt er tijdens de studiedag 135 ml afgenomen
zodat hiermee het circulerend volume bepaald kan worden, maar ook de opbrengst
en klaring van de biotineRBCs en metabolomics plaats kan vinden. Daarnaast
worden de verschillende popoulaties RBCs (vers en opgeslagen) uit de veneuze
samples gehaald worden zodat hier metabolomics en enzymactiviteit in bepaald
kan worden. Deze assays zullen gebruikt worden om het effect van opslagduur op
enzymactivteit te bepalen en te onderzoeken hoe getransfundeerde cellen
herstellen na transfusie.

Follow-up na de studiedag
Vierentwintig en 48 uur na transfusie komen de vrijwilligers terug naar het AMC
voor afname van een extra bloedsample (12 ml). Zeven, 30 en 90 dagen na
transfusie worden eveneens bloedsamples afgenomen (12 ml) die worden gebruikt
om vast te stellen of vrijwilligers antilichamen tegen biotine ontwikkelen.
Deze data wordt gebruikt om de prevalentie van biotine-antistoffen na
blotostelling aan intraveneus biotine te bepalen. De antistoffen zullen met een
IgG gel card test bepaald worden (Ortho Clinical Diagnostics, MTS* Anti-IgG
Card).

Screening Alle gezonde vrijwilligers (leeftijd tussen 18-35 jaar) zullen op het AMC en bij Sanquin gescreend worden alvorens inclusie. De screening omvat een anamnese met medische voorgeschiedenis, lichamelijk onderzoek, ECG en bloed- en urineonderzoek. Vrijwilligers kunnen niet aan de studie deelnemen als er afwijkingen bij de screening gevonden worden. Vrijwilligers kunnen eveneens niet aan de studie deelnemen als zij medicatie op doktersvoorschrift gebruiken, meer dan 500 ml bloed hebben verloren in de 3 maanden voorafgaand aan de screening of als zij aan een andere interventiestudie deelnemen. Als de vrijwilligers geen exclusiecriteria hebben, zullen zij gerandomiseerd worden in één van de 4 groepen. Alle geïncludeerde gezonde vrijwilligers (n=20) zullen 35 dagen voor het experiment 1 unit volbloed bij Sanquin doneren. Hiervan zal 1 unit RBCs gemaakt worden (ongeveer 300 ml). De fabricage en opslag zullen volgens Sanquin standaarden zijn. De producten worden afhankelijk van de randomisatie in SAGM of in een alkaline bewaarvloeistof als PAGGGM, AS-7 of E-SOL opgeslagen. Elke week worden de producten gemonsterd met een steriel afnamesysteem. Twee dagen voor het experiment zullen de vrijwilligers een tweede donatie doen. Het volume hiervan zal ongeveer 200 ml zijn. Deze donatie zal met een volbloed leukodepletie filter omgezet worden in een Sanquin gevalideerd RBC transfusieproduct. Beide RBC concentraten zullen met biotine gelabeld worden. Hiervoor worden twee verschillende concentraties biotine gebruikt worden zodat de populaties met FACS volgens eerder gepubliceerde protocollen geïdentificeerd kunnen worden. Om uit te sluiten dat de concentratie biotine waarmee de cellen gelabeld worden van invloed is, wordt de helft van de verse producten met een lage concentratie biotine gelabeld en de oude producten met een hoge concentratie. Bij de andere helft worden de verse producten met een hoge concentratie biotine gelabeld en de oude producten juist met een lage concentratie. Voor de studiedag zullen de vrijwilligers tijdens de screening en tweetal bloeddonatie in totaal ongeveer 735 ml bloed doneren. Dit is gelijk aan ongeveer 15% van het circulerende volume van een man van 175. Dit volume is de maximale toegestane hoeveelheid die volgens de richtlijnen van Sanquin Bloed Bank gedoneerd mag worden. De bloeddonaties zullen echter gebruikt worden om autologe bloedproducten van te maken die de vrijwilligers op de studiedag getransfundeerd zullen krijgen waardoor de vrijwilligers het grootste gedeelte van het afgenomen bloed weer terug krijgen. Twee dagen na de tweede, kleinere donatie, zullen de vrijwilligers opgenomen worden op de medium care van het AMC. Daar zullen zij eerst een infuus met indicyanine ontvangen. Dit zal gebruikt worden om het circulerend volume te bepalen. Dit zal gevolgd worden door infusie van zowel de de biotine gelabelde 2 dagen opgeslagen RBCs als de biotine gelabelde 35 dagen opgeslagen RBCs. Tijdens de studiedag zal er bloed afgenomen worden uit een infuus. Bloed wordt vlak voor de indocyanine groen infusie, 5, 10 en 20 minuten na indocyanine groen infusie, voor transfusie en 10 minuten, 0.5, 1, 2, 4, 6 en 8 uur na transfusie afgenomen. De vrijwilligers komen 24 uur na transfusie en 2, 7, 30 en 90 dagen na transfusie terug voor follow-up samples. Deze samples worden gebruikt om de twee gelabelde popoulaties RBCs te isoleren zodat hier aanvullend onderzoek op verricht kan worden. De indocyaine groen gift zal gebruikt worden om het circulerend volume te bepalen. Deze bepaling is nodig om vast te stellen of er in de eerste minuten na infusie al klaring is van getransfundeerde RBCs. Deze klaring kan niet vastgesteld worden zonder eerst het circulerend volume vast te stellen. In samenwerking met een laboratorium in de Verenigde Staten, zal het energiemetabolisme van RBCs in de transfusiezak met metabolomics bepaald worden. Daarnaast zullen de getransfundeerde RBCs uit de veneuze samples geïsoleerd worden en zal hier eveneens metabomics op toegepast worden. Deze analyses zullen gecombineerd worden met directe enzymassays (spectrofotometrie en cytofluorometrie van bijvoorbeeld glucose-6-fosfaat dehydrogenase) om behalve de producten van enzymmatige processen ook de snelheid van de processen te bepalen. Zo kunnen we het effect van opslagduur op enzymactiviteit in de RBC bepalen en vast stellen in hoeverre de cel na transfusie herstelt. Gedurende het experiment worden de vrijwilligers gemonitord op de medium care. Er zal continue registratie plaatsvinden van de hartslag, saturatie en bloeddruk middels niet-invasieve monitoring. De samples die 1, 2, 7, 30 en 90 dagen na transfusie worden afgenomen (12 ml) worden ook gebruikt om de klaring van RBCs te bepalen en om vast te stellen of vrijwilligers antilichamen tegen biotine ontwikkelen. Deze data wordt gebruikt om de prevalentie van biotine-antistoffen na blotostelling aan intraveneus biotine te bepalen. De antistoffen zullen met een IgG gel card test bepaald worden (Ortho Clinical Diagnostics, MTS> Anti-IgG Card).

Voordelen voor vrijwilliger: geen.
In een recent gepubliceerd onderzoek hebben wij laten zien dat het veilig en
mogelijk is om biotine gelabelde autologe RBCs te transfunderen in
vrijwilligers die aan lipopolysaccharide geïnduceerde endotoxemie leden. In
deze studie zal geen endotoxemie opgewekt worden waardoor wij het heel
onwaarschijnlijk achten dat de autologe transfusie een adverse event zal
veroorzaken. Daarnaast worden alle bloedproducten volgens de
kwaliteitsstandaarden van Sanquin gemaakt. gepaard zal gaan. Wij zijn van
mening dat deze studie hierdoor een lage belasting is voor de gezonde
vrijwilligers.

Voor transfusie worden de RBCs met biotine gelabeld zodat deze na transfusie
met flow cytometrie (FACS) geïdentificeerd kunnen worden. In vivo en in vitro
tests van gebiotinyleerde RBCs lieten zien dat de functie en opbrengst van RBCs
niet beïnvloed wordt door het labelen. In een gezonde vrijwilligersstudie bleek
wel dat 12.5% van de vrijwilligers antistoffen tegen biotine ontwikkeld. Deze
zijn na een jaar echter weer verdwenen en hebben geen klinische relevantie.
Herhaling van een biotine gelabelde transfusie heeft geen nadelige gevolgen
voor de vrijwilliger, anders dan dat de getransfundeerde cellen soms sneller
uit de circulatie verdwijnen. In onze reeds gepubliceerde studie, ontwikkelde
geen van de vrijwilligers antistoffen. Desondanks zullen wij monitoren of
vrijwilligers antistoffen ontwikkelen. Deze monitoring is puur voor
onderzoeksdoeleinden.

De vrijwilligers zullen in 3 sessies ongeveer 735 ml bloed doneren (screening,
donatie van 35 dagen voor de studiedag en donatie 2 dagen voor de studiedag).
Dit komt overeen met 15% van het totaal circulerend volume in een 175 cm lange,
gezonde man. Deze mannen kunnen deze afname in bloedvolume zonder nadelige
gevolgen weer aanmaken. Deze hoeveelheid is echter wel meer dan een standaard
donatie bij Sanquin. Daarom zal het protocol ook nog ter goedkeuring voorgelegd
worden aan de ethische commissie van Sanquin. Gedurende de studiedag zullen de
vrijwilligers hun bloeddonaties getransfundeerd krijgen. Het totale
bloedverlies zal daardoor bij het einde van de studie minimaal zijn.