Glycocalyx bepaling in temporaalkwab epilepsie

Dit onderzoek richt zich op de pathofysiologie/etiologie van epilepsie.
Epilepsie is na cerebrovasculaire aandoeningen de meest voorkomende
neurologische aandoening. Het meest voorkomende type epilepsie is temporaalkwab
epilepsie (TLE), de vorm die wij willen onderzoeken. De impact van epilepsie op
het leven van een patiënt is enorm. De daarmee samenhangende socioeconomische
gevolgen en vraag van de gezondheidszorg zijn gigantisch.
De primaire behandeling van epilepsie is medicamenteus met zogenaamde
anti-epileptica. Helaas is 30% van de patiënten medicatie-resistent of kan de
bijwerkingen van de anti-epileptica niet verdragen. In sommige gevallen komen
patiënten dan in aanmerking voor een operatie, iets wat bijvoorbeeld mogelijk
kan zijn bij temporaalkwab epilepsie waarvan de focus middels een lang
diagnostisch traject is vastgesteld. Maastricht is een van de drie centra in
Nederland waar deze operatie wordt uitgevoerd.

De etiologie en pathofysiologie van epilepsie zijn reeds vele jaren onderwerp
van onderzoek. Zo zijn verschillende risicofactoren voor het ontwikkelen van
TLE gevonden zoals febriele convulsies en traumatisch hersenletsel als kind.
Daarnaast zijn er pathologische afwijkingen gevonden het weefsel van overleden
en geopereerde TLE-patiënten, bijvoorbeeld hippocampale sclerose en mossy fiber
sprouting in de hippocampus met een verstoord neuraal netwerk tot gevolg. Ook
zijn er veel aanwijzingen voor een rol voor neuroinflammatie in de
epileptogenese. Recent onderzoek richt zich op de rol van de
bloed-hersenbarrière (BBB), zo heeft het openen van de BBB insulten tot gevolg
en is een verhoogde permeabiliteit van de BBB aangetoond in TLE-patiënten. Het
onderliggende principe hiervan is nog onbekend.

In het huidige voorgestelde onderzoek zijn wij geïnteresseerd in de
eigenschappen van de microcirculatie als eerste barrière van bloed naar
hersenen in de BBB. Het betreft dan specifiek de glycocalyx. De glycocalyx is
een dunne gelachtige laag die zich bevindt aan de luminale zijde van het
endotheel en ook aan dit endotheel verankerd is. De glycocalyx speelt een
centrale rol in de vasculaire homeostase en beschermt het endotheel ook voor
het circulerende bloed. Recent onderzoek heeft laten zien dat een dunnere
glycocalyx de vasculaire permeabiliteit verhoogt en dat inflammatie de
glycocalyx kan aantasten. Daarnaast verstoord traumatisch hersenletsel de
functie van de glycocalyx. Niet eerder werd de relatie tussen glycocalyx en
(temporaalkwab) epilepsie onderzocht. De uitgebreide ervaring met glycocalyx
metingen en de eerste toepassing hiervan op hersenweefsel in vivo is dan ook
een unieke combinatie

Primair doel van het onderzoek: De eigenschappen van de glycocalyx in
temporaalkwab epilepsie(TLE) patiënten in kaart brengen.

Secundaire doelen van het onderzoek zijn:
- Aantonen van verschillen in de eigenschappen van de glycocalyx van
TLE-patiënten in vergelijking met controle patiënten.
- Aantonen van een correlatie tussen de sublinguale glycocalyxmetingen en de
corticale (en hippocampale) glycocalyxmetingen bij TLE-epatiënten en controle
patiënten.
- Aantonen van verschillen in de eigenschappen van de glycocalyx van
TLE-patiënten met hippocampale sclerose en zonder hippocampale sclerose.
- Aantonen van verschillen in de eigenschappen van de glycocalyx van
TLE-patiënten met een voorgeschiedenis met febriele convulsies en/of
traumatisch hersenletsel in vergelijking met epilepsiepatiënten zonder een
dergelijke voorgeschiedenis.
- Aantonen van een correlatie van glycocalyx eigenschappen van TLE-patiënten
met epilepsie-gebonden factoren zoals insulttype en insultfrequentie.
- Aantonen dat kleine corticale arteriën levensvatbaar zijn in acute in-vitro
experimenten door gebruik te maken van een arteriograaf.
- Aantonen dat de neurovasculaire unit in kleine corticale arteriën
levensvatbaar is in een in-vitro opstelling door gebruik te maken van een
arteriograaf en electrische veldstimulatie.
- Aantonen dat de glycocalyx ook gemeten kan worden in kleine corticale
arteriën in een in-vitro opstelling door gebruik te maken van een arteriograaf
en een 2-foton microscoop. De resultaten hiervan worden gecorreleerd aan de
resultaten van de in-vivo experimenten.

In het MUMC+ worden jaarlijks 30-40 patiënten geopereerd vanwege
medicatie-resistente localisatie-gerelateerde epilepsie middels resectieve
hersenchirurgie. Deze patiënten hebben een uitgebreid diagnostisch traject
afgelegd om de localisatie-gebonden epilepsie te bewijzen en de localisatie te
bewijzen. Wanneer dan ook de verwachting is dat patiënten aanvalsvrij of een
forse insultfrequentie reductie zullen hebben als gevolg van de resectie komen
patiënten in aanmerking voor de bovengenoemde resectie. Dit traject en de
indicatiestelling vindt plaats via het Academisch Centrum voor Epilepsie.

In de meeste gevallen is er sprake van TLE waarbij het focus zich bevindt in de
mesiotemporale regio, in casu de amygdala en hippocampus. Een aanvalsvrij
resultaat na een temporaalkwab resectie inclusief resectie van de
(sclerotische) hippocampus en amygdala wordt bereikt bij ongeveer 70% van de
patiënten. Tijdens een dergelijke operatie is eerst een groot deel van de
cortex van temporaalkwab zichtbaar. Dit geeft ons de unieke mogelijkheid om de
glycocalyx lokaal te meten door de camera direct op het weefsel te plaatsen.
Eerst kan dan de corticale glycocalyx beoordeeld worden en daarna de
hippocampale glycocalyx. Dit zal de operatietijd, die normaliter drie tot vier
uur is met maximaal vijf minuten verlengen.

De controle populatie bestaat uit patiënten die een craniotomie of boorgat
ondergaan ten behoeve van respectievelijk neurovasculaire chirurgie en
tumorresectie, of tumorbioptie. Bij deze patiënten bestaat ook de mogelijkheid
om dezelfde probe op gezond corticaal weefsel te plaatsen alvorens het wordt
verwijderd bij de corticotomie. Bij neurovasculaire patiënten zal zelden
weefsel worden verwijderd. Dan wordt de probe op gezond niet-eloquent weefsel
gehouden.

De camera is in het verleden succesvol toegepast op humaan weefsel zoals de
nieren en sublinguaal.

Methode
De studie betreft een observationele case-control studie. Om voldoende
patiënten te includeren is de looptijd van de studie vier jaar.

Metingen
De glycocalyx meting wordt uitgevoerd met een kleine video-microscoop (SDF
camera, MicroVision Medical, Amsterdam, CE-gecertificeerd, Maastricht
University registratie nummer H.08IHVI06265).Tijdens de meting wordt
automatisch in 3000 vaatsegmenten met en diameter van 5-30 micrometer de
breedte van de "rode bloedcel kolom"(RBC) bepaald. Vervolgens wordt door de
GlycoCheck ICU software de perfused boundary region (PBR) berekend voor alle
vaatsegmenten.

In alle patiënten (epilepsie en controle) zal een standaard sublinguale
glycocalyxmeting plaatsvinden, dit is meting 1.
Meting 1.:Direct na anesthesie inductie. Locatie: operatiekamer. De patiënt
krijgt niks mee van deze meting.

Vervolg methode bij TLE-patiënten:
Meting 2: Corticale meting wanneer cortex voldoende à vue. Locatie:
operatiekamer.
Meting 3: Na resectie van de cortex komt de hippocampus in beeld, dit is
doorgaans ongeveer 30 minuten na de cortexresectie. Wanneer de hippocampus
duidelijk à vue is zal de derde meting plaatsvinden. Locatie: operatiekamer.

Vervolg methode bij controle patiënten:
Meting 2: Corticale meting wanneer cortex voldoende à vue. Locatie:
operatiekamer.

De toegevoegde operatietijd wordt geschat op maximaal 10 minuten. Direct
aansluitend aan de laatste meting heeft de proefpersoon het eindpunt van de
studie bereikt.

Tijdens de operatie wordt bij de epilepsiepatiënten en de tumorpatiënten van de
controlegroep een significante hoeveelheid hersenweefsel verwijderd. In het
geval van TLE-patiënten gaat een deel van de cortex en hippocampus naar de
pathologie voor beoordeling (bijvoorbeeld voor beoordeling van hippocampale
sclerose), dit is een standaard procedure die geen betrekking heeft op dit
onderzoek. Het overige deel van de cortex en hippocampus wordt gebruikt voor
onderzoeksdoeleinden.In het laboratorium worden onder andere directe (in vitro)
metingen van de microcirculatie uitgevoerd zoals vasculaire permeabiliteit en
glycocalyx kwaliteit. Andere delen van de cortex en hippocampus worden
opgeslagen in onze biobank.

Aanvullende informatie over deze in vitro bepalingen:
In vitro experimenten: epilepsie patiënten.
Tijdens een standaard temporaalkwab resectie met amygdalohippocampectomie wordt
een deel van de cortex, amygdala en hippocampus en bloc weggenomen. Na resectie
zal dit weggenomen weefsel in verschillende delen worden gesneden vanwege
klinische en onderzoeksrelevante redenen. Dit weefsel wordt overigens beschouwd
als restmateriaal.

Als standaard klinische procedure wordt een deel van de cortex, hippocampus en
de gehele amygdale naar de afdeling Pathologie verstuurd. Aldaar worden
belangrijke parameters als focale corticale dysplasie en (de mate van)
hippocampale sclerose beoordeeld door de patholoog. Aangezien deze parameters
belangrijk zijn voor ons onderzoek zullen de uitkomsten hiervan worden
meegenomen in de klinische data en bij de resultaten als secondaire
parameters/uitkomstmaten.

Een tweede deel van de cortex en hippocampus wordt direct op droog-ijs
ingevroren. Deze stukjes weefsel worden opgeslagen in onze bio-bank (diepvries
-80 graden Celsius). Het weefsel in onze bio-bank kan gebruikt worden voor
toekomstig onderzoek, bijvoorbeeld genetische analyse. Wanneer experimenten aan
dit weefsel bedacht/gepland worden zal dit eerst aan de METC worden voorgelegd.

Een derde deel van het corticale en hippocampale weefsel wordt gefixeerd in
Formaldehyde. Na twee dagen fixatie wordt het weefsel ingebed in parafinne.
Nadien wordt dit weefsel opgeslagen in de histologische bio-bank. Deze bio-bank
bevindt zich in het MHeNS lab in een afsluitbare kast op een afsluitbare kamer,
kamer van G. Hoogland. Alleen O. Schijns, R. Haeren en G. Hoogland kunnen bij
deze gegevens. Wanneer het weefsel voor pathologische onderzoek te gering was
kan aanvullend pathologisch onderzoek worden gedaan met behulp van dit weefsel.
Het weefsel in deze bio-bank kan gebruikt worden voor toekomstig onderzoek.
Wanneer experimenten aan dit weefsel bedacht/gepland worden zal dit eerst aan
de METC worden voorgelegd.

Een vierde deel van het corticale weefsel (hippocampale vasculaire structuren
zijn te klein om te gebruiken) wordt direct in een HEPES-buffer opgeslagen.
Daarna vinden acute vasculaire experimenten aan dit weefsel plaats. Dit weefsel
wordt maximaal 48uur opgeslagen. Na die tijd worden de vasculaire structuren
niet meer levensvatbaar en daarmee bruikbaar geacht voor onze onderzoeksideeën.

Allereerst zijn we geïnteresseerd naar het functioneren van de neurovasculaire
unit in vaten van het gereseceerde cortex weefsel. Met behulp van
microdissectie kunnen vaatsegmenten worden vrijgeprepareerd. Vervolgens wordt
een vaatsegmengt in een arteriograaf geplaatst. De arterie bevindt zich een
orgaanbak met HEPES-buffer en wordt tussen twee glazen cannules geplaatst.
Hierover loopt een continue flow met een uitwendige druk van 70mmHg. Vervolgens
worden sterke vasocontrictieve farmaca toegediend, gevolgd door vasodilatantia.
Op deze manier kan de levensvatbaarheid van deze vasculaire structuren worden
beoordeeld. Wanneer de vaten levensvatbaar zijn kan met behulp van agonisten en
antagonisten de gehele vasoconstrictie en vasodiliatatie cascade in kaart
worden gebracht. Tevens kan vasculaire permeabiliteit worden bepaald door het
verschil te bepalen tussen extra- en intraluminale toediening van een
vasocontrictief farmacum.

Wanneer de vaten levensvatbaar zijn kan extraluminale electrische
veldstimulatie worden toegepast om de neurovasculaire unit te beoordelen.
Opnieuw kan met behulp van vasoconstrictieve/vasodilatieve farmaca en
agonisten/antagonisten de gehele cascade in kaart worden gebracht. Deze
'levensvatbaarheidsmetingen' zijn onder andere belangrijk om te beoordelen of
de vaten bruikbaar zijn voor glycocalyx analyse. De glycocalyx is bij in-vitro
opstelling namelijk zeer snel

Allereerst is er de enorme impact van de aandoening op het leven van
temporaalkwab epilepsie patiënten, die door onze onbekendheid naar de
pathofysiologie nog altijd bij een groot deel van de patiënten onvoldoende
medicamenteus behandeld kan worden. De studie levert ons unieke informatie op
over de pathofysiologie van (temporaalkwab) epilepsie.

De sublinguale glycocalyx metingen zijn niet invasief, niet pijnlijk en duren
slechts enkele minuten. De metingen worden gedaan wanneer patiënt onder
algehele narcose is. De metingen zijn daarmee niet belastend voor de patiënt,
en het risico is zeer beperkt. Het risico op een lokale contusie door aanraking
van cortex of hippocampus met de camera is minimaal en indien dit het geval is
zal dit geen nadeel tot gevolg hebben omdat het weefsel vanwege de operatie
gereseceerd zou worden m.u.v. de neurovasculaire patiënten.

De operatietijd wordt verlengd met maximaal 10 minuten, een tijdsinvestering
die we gerechtvaardigd achten op een totale operatietijd van 3-4 uur.

Al bij al achten we het gerechtvaardigd om deze studie uit te voeren.