Rol en effect van amyloïde eiwitten op NET-vorming in het centrale zenuwstelsel

Neutrofielen worden actief geworven als eerstehulpverleners op plaatsen van
infecties en beschermen ons lichaam tegen infiltratie van schadelijke
pathogenen. Na stimulatie ondergaan neutrofielen een specifiek
celdoodmechanisme genaamd NETosis, wat een kritische aangeboren immuunrespons
is die wordt gekenmerkt door ROS-productie en de afgifte van chromatine
versierd met antimicrobiële peptiden en serineproteasen, vergezeld van
verschillende pro-inflammatoire en immunostimulerende moleculen. Hoewel tot 60%
van ons circulerend bloed uit neutrofielen bestaat, zijn ze bij gezonde
personen vrijwel afwezig in het centrale zenuwstelsel. Onlangs is echter
ontdekt dat neutrofielen de anders beschermende bloed-hersenbarrière kunnen
passeren en onze hersenen kunnen binnendringen onder specifieke
neuropathologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer (AD), multiple
sclerose (MS), amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van
Parkinson. (PD).

In overeenstemming met de aanwezigheid van neutrofielen in de zieke hersenen,
wordt het steeds duidelijker dat bacteriële infecties kunnen bijdragen aan het
ontstaan **van verschillende neurologische pathologieën in de ontwikkeling.
Chronische parodontale infectie werd bijvoorbeeld in verband gebracht als een
mogelijke oorzaak van de ziekte van Alzheimer en Porphyromonas gingivalis werd
onlangs geïdentificeerd als een keystone-pathogeen. Hier werd een positieve
correlatie gevonden tussen bacteriële infectie en de vorming van Aβ-plaques,
een kenmerkend kenmerk van AD en waarvan recentelijk is vastgesteld dat het
antimicrobiële eigenschappen heeft. In overeenstemming met hun rol in
aangeboren immuniteit, werden neutrofielen ook gevonden in de omgeving van Aβ-
afzettingen en de verminderde corticale bloedstroom die vaak wordt waargenomen
bij AD-patiënten werd toegeschreven aan neutrofielenadhesie in
hersencapillairen. Op een vergelijkbare manier werden neutrofielen en
neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) ook gevonden in de cerebrospinale
vloeistof van patiënten met andere neurodegeneratieve ziekten zoals MS.

Naast het momenteel geaccepteerde mechanisme van microbiële-geïnduceerde
neutrofielactivering en NET-vorming, werd onlangs aangetoond dat
amyloïdefibrillen zelf uit drie verschillende eiwitbronnen (bijv. α-synucleïne,
Sup35 en transthyretine) ook in vitro NET-vorming induceerden. De begeleidende
afgifte van NET-geassocieerde proteasen degradeerde de amyloïde fibrillen
verder tot kortere peptideproducten die verhoogde toxiciteit voor lever- en
niercellen vertoonden. Vanwege de betrokken celbeschadigende processen is het
verleidelijk om te speculeren dat door amyloïde geïnduceerde NETosis bijdraagt
**aan neurotoxiciteit. De in vivo pathogene relevantie van de aanwezigheid van
neutrofielen in hersenweefsel en het effect van de bijbehorende NET's op
neuronale cellen en ziekteprogressie is echter nog niet systematisch
onderzocht.

In dit onderzoeksvoorstel willen we chemische reportermoleculen ontwikkelen om
neutrofiele activiteit en NET-vorming in realtime te bestuderen. We zullen
systematisch het effect van hersengeassocieerde amyloïde fibrillen op
NET-vorming bestuderen en het effect van de begeleidende secretiemoleculen op
neuronale activatie en synapsgroei in vitro en in vivo onderzoeken. De
specifieke doelstellingen zijn als volgt:

1. Ontwikkeling van moleculaire reporters en op activiteit gebaseerde sondes om
NET's in vitro en in vivo te bestuderen en te identificeren.
2. Evalueer de infiltratie en activering van neutrofielen bij
neurodegeneratieve aandoeningen met behulp van immunokleuring en op activiteit
gebaseerde sondes.
3. Evalueer het effect van amyloïden en aggregaten op NET-vorming op
geïsoleerde neutrofielen in vitro.
4. Evalueer het effect en de toxiciteit van NET's op neuroncellen.

Om neutrofielen en NET-vorming in vitro en in vivo te bestuderen, zullen we
activity-based probes (ABP) ontwikkelen voor een reeks eiwitten die specifiek
worden uitgescheiden door neutrofielen tijdens NETosis, namelijk neutrofiel
elastase (NE), cathepsin G (CatG), Peptidyl Arginine Deiminase (PAD) en
Myeloperoxidase (MPO). De bereide sondes zullen eerst worden geëvalueerd op hun
geschiktheid om enzymactiviteit tijdens NETosis op neutrofielen te detecteren.

Het proces van NETose kan worden gestart door verschillende triggers en
verlopen via een NADPH-oxidase-afhankelijke en een NADPH-oxidase-onafhankelijke
route. Beide routes resulteren in NET's met een unieke moleculaire
samenstelling en het is daarom interessant om het effect van amyloïde-
geïnduceerde NETose in meer detail te onderzoeken. Hier willen we onderzoeken
of amyloïde-eiwitten van verschillende structuur en grootte neutrofielen
activeren en NETosis induceren. We zullen verschillende conformaties van
amyloïde genereren, variërend van monomeren tot oligomeren en fibrillen met
behulp van gevestigde protocollen, en deze in vitro met neutrofielen incuberen.
Activering zal worden gekwantificeerd met behulp van de op activiteit
gebaseerde sondes en door NETosis

Neutrofielen zijn van zeer korte duur (ongeveer 1 dag) en moeten daarom worden
geïsoleerd uit vers bloedmonsters. Bloedmonsters (10-40 ml) worden afgenomen
via venapuctie in het RadboudUMC in EDTA-antistollingsbuisjes na ondertekende
geïnformeerde toestemming. De exacte hoeveelheid hangt af van de aard van het
geplande experiment en het aantal neutrofielen en is nodig om het uit te
voeren. Donoren zullen niet in de loop van de tijd worden gevolgd of worden
onderworpen aan andere procedures dan het doneren van bloed. Dit onderzoek zal
geen bevindingen opleveren die stressvol of klinisch relevant kunnen zijn voor
de donoren, aangezien de enige klinische parameter die zal worden gecontroleerd
het celgetal is.

Neutrofielen zullen worden geïsoleerd uit het gedoneerde bloed volgens de
standaard operationele procedures (SOP) en daaropvolgende in vitro-experimenten
zullen worden uitgevoerd op de dag van donatie. Nadat de experimenten zijn
voltooid, worden alle materialen weggegooid; biomaterialen die bij dit
onderzoek betrokken zijn, worden niet opgeslagen.

Risico en lasten: risico is verwaarloosbaar en de last is minimaal. De meest
voorkomende risico's die verband houden met bloeddonatie uit de arm van de
proefpersoon zijn korte pijn en/of blauwe plekken. Infectie, overmatig bloeden,
stolling of flauwvallen zijn ook mogelijk, maar onwaarschijnlijk.

Voordelen: er is geen ander voordeel dan een waardebon van 15¤ voor Bol.com.
Deelname van het onderwerp zal de onderzoekers echter helpen om kennis op te
doen.