Opzetten van een "twee hit" autoloog bloedplaatjes transfusiemodel in gezonde vrijwilligers

Transfusie-gerelateerde acute longschade (TRALI) is de belangrijkste oorzaak
van transfusie-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit. TRALI wordt beschouwd
als een "twee hit" syndroom. De eerste *hit* is de onderliggende aandoening van
de patient, bijvoorbeeld sepsis of een infectie. De *eerste hit* resulteert in
priming van neutrofiele granulocyten. De *tweede hit* is de transfusie van een
bloedproduct, waarbij antilichamen aanwezig in een plasma bevattend
bloedproduct of pro-inflammatoire stoffen aanwezig in opgeslagen cel-bevattende
bloedproducten (bijvoorbeeld rode bloedcellen (RBC), bloedplaatjes (PLTs)) of
de oude erytrocyten en/of bloedplaatjes de geprimede neutrofielen activeren.
Deze activatie leidt uiteindelijk tot longoedeem oftewel TRALI.
In tegenstelling tot de traditionele opvatting dat TRALI een goede prognose
heeft, laten recente studies zien dat TRALI een aanzienlijk effect op
morbiditeit en sterfte heeft. Dit blijkt vooral te gelden voor specifieke
patiëntengroepen zoals intensive care patiënten. De associatie tussen
transfusie en sterfte heeft geresulteerd in aanpassing van het donatiebeleid
gericht op het verminderen van het risico van het optreden van TRALI.
Plasmaproducten die afkomstig zijn van vrouwelijke donoren en meer specifiek
multipara donoren hebben een hoger risico (tot wel 40%) op de aanwezigheid van
antilichamen gericht tegen leukocyten antigenen en zijn geassocieerd met het
optreden van TRALI. Dit was een reden voor Nederland en het Verenigd Koninkrijk
om vanaf 2006 en 2003 respectievelijk een *male only* plasma donatiebeleid te
introduceren. Door het uitsluiten van vrouwelijke donoren voor plasmadonatie is
de incidentie van TRALI afgenomen, maar deze maatregel was niet voldoende om
het optreden van TRALI volledig te voorkomen. Meer onderzoek is nodig om te
bepalen of het gebruik van verse (in Nederland worden RBC maximaal 35 dagen
opgeslagen en bloedplaatjes maximaal 7 dagen) cel-bevattende bloedproducten een
aanvullende maatregel voor het verminderen van TRALI zou kunnen zijn.
We hebben onlangs aangetoond in een in vivo diermodel dat het supernatant van
opgeslagen bloedplaatjes milde longschade veroorzaakt in de aanwezigheid van
een "eerste hit" van lipopolysaccharide (LPS). Klinische studies laten echter
tegenstrijdige resultaten zien over de gevolgen van transfusie van opgeslagen
PLTs en het ontstaan van respiratoire complicaties. Zoals hierboven beschreven
is de gedachte dat opslagduur van cel bevattende bloedproducten (zoals
bloedplaatjes) geassocieerd is met het ontwikkelen van TRALI. Het opzetten van
een gerandomiseerde trial zou een logische stap zijn. Hoewel recente studies
een relatief hoge incidentie van TRALI laten zien, is de incidentie in de
algemene patienten populatie nog steeds laag. Bovendien is de aanwezigheid of
afwezigheid van een "eerste hit" moeilijk te meten in de klinische setting. Dit
samen maakt het zeer moeizaam om een gerandomiseerde klinische trial uit te
voeren. Om deze reden stellen wij voor om een 'twee hit" in vivo autoloog PLTs
transfusie model op te zetten, dat wil zeggen een mild TRALI model bij gezonde
vrijwilligers. Het model kan antwoord geven op de vraag of in de klinische
setting opgeslagen PLTs producten mild long letsel veroorzaken in aanwezigheid
van een "eerste hit" (dat wil zeggen een milde vorm van TRALI).

De voordelen van een dergelijk model zijn de volgende; 1) een autoloog
transfusie model maakt het mogelijk om het effect van opslagduur op het
ontstaan van longschade selectief te onderzoeken aangezien antilichaam
gemedieerde TRALI is uitgesloten; 2) de "eerste hit" is gestandaardiseerd; 3)
dit model kan ons helpen identificeren welke mechanismen betrokken zijn bij het
ontstaan van opgeslagen PLTs geïnduceerd long letsel en kan in de toekomst
gebruikt worden om preventieve of therapeutische behandelingen te testen en
voor het optimaliseren van de bewaarmethoden voor PLTs. Een controle arm waarin
NaCl 0.9% wordt toegediend als "first hit" in plaats van LPS faciliteert
onderzoek naar de effecten van opgeslagen bloedplaatjes in een circulatie die
niet geprimed is met LPS. Eerdere onderzoek naar autologe
bloedplaatjestransfusie in gezonde vrijwilligers hebben wel transfusiekinetiek
en opbrengst van opgeslagen plaatjes onderzocht, maar hierin is niet naar het
effect van opslagduur op coagulatie en inflammatie gekeken. De additie van deze
controle arm maakt dat in ons onderzoek mogelijk.
Wij stellen daarom de ontwikkeling van een "two hit" in vivo autoloog PLTs
transfusie model voor. Dat wil zeggen, een mild TRALI model in gezonde
vrijwilligers om te onderzoeken of de opslagduur van PLTs ook in mensen
gerelateerd is aan ontstaan van TRALI na een "first hit" met LPS.

Het opzetten van een *twee hit* in vivo autoloog bloedplaatjestransfusie model
in gezonde mannelijke vrijwilligers.

Open label gerandomiseerde interventie trial

In totaal zullen 36 vrijwilligers meedoen aan de studie verdeeld over 6 groepen
van 6:
Groep 1 (6 personen): "first hit" Lipopolysaccharide (LPS) 2ng/kg i.v. +
"second hit" fysiologisch zout i.v.
Groep 2 (6 personen): "first hit" LPS i.v. + "second hit"
bloedplaatjestransfusie (2 dagen opslag)
Groep 3 (6 personen): "first hit" LPS i.v. + "second hit"
bloedplaatjestransfusie (7 dagen opslag)
Groep 4 (6 personen): "first hit" Fysiologisch zout 10 ml i.v. + "second hit"
fysiologisch zout i.v.
Groep 5 (6 personen): "first hit" Fysiologisch zout 10 ml i.v. + "second hit"
bloedplaatjestransfusie (2 dagen opslag)
Groep 6 (6 personen): "first hit" Fysiologisch zout 10 ml i.v. + "second hit"
bloedplaatjestransfusie (7 dagen opslag)

Methoden: Alle proefpersonen zullen voor deelname aan het onderzoek worden gescreend (medische voorgeschiedenis, lichamelijk onderzoek, ECG, bloed onderzoek, spirometrie, DLCO, thoraxfoto) door de arts-onderzoeker van ons ziekenhuis en van de bloedbank Sanquin. Alle geincludeerde gezonde vrijwilligers (n = 36) zullen 1 eenheid apherese bloedplaatjesdoneren bij de bloedbank Sanquin. Deze bloeddonaties zullen worden verwerkt tot 1 eenheid apherese bloedplaatjes (PLTs) . Verwerking en opslag zal volgens het standaard protocol van Sanquin gebeuren. Voor transfusie worden de bloedplaatjes onder steriele condities gelabeld met biotine (vitamine B8, Suflo-NHS van Pierce, 25 microgram per milliliter) zodat de cellen na transfusie middels flow cytometrie geïdentificeerd kunnen worden voor aanvullend onderzoek. Op de studiedag zelf zullen de gezonde vrijwilligers een "eerste hit" van E. coli lipopolysaccharide (LPS) 2 ng/kg i.v. (n = 18) of NaCl 0.9% 10 ml (n = 18) toegediend krijgen. Anderhalf uur na de LPS wordt het circulerend volume berekend met behulp van intraveneuze toediening van indocyaninegroen. Twee uur na de "eerste hit" ontvangen zij een autologe transfusie van 1 eenheid verse (2 dag opslag) gebiotinileerde PLTs of een autologe transfusie van 1 eenheid oude gebiotinileerde PLTs (7 dagen van de opslag) of een gelijkwaardige hoeveelheid natriumchloride 0,9% infusie. De transfusie zelf zal worden uitgevoerd in één uur. Tijdens het experiment worden de bloeddruk en arteriële oxygenatie via een arteriële lijn gemeten. Bloedmonsters worden uit de arterielijn voorafgaand aan de "eerste hit", voorafgaand aan de indocyaninegroen toediening, 5, 10 en 20 minuten na de indocyaninegroen toediening, voorafgaand aan de transfusie, 10 minuten, 0,5, 1 en 2, 4 en 6 uur na de transfusie afgenomen. Daarnaast zal na 6 uur opnieuw spirometrie en DLCO meeting plaatsvinden. Een thoraxfoto en een broncho-alveolaire lavage (BAL) zal eveneens 6 uur na de transfusie worden uitgevoerd. De BAL zal worden uitgevoerd door een ervaren longarts volgens de Nederlandse richtslijnen van longartsen (NVALT, 2004). In de BAL-vloeistof en plasma monsters zullen ontstekingsmarkers, markers voor neutrofiel activatie en stollings markers worden gemeten om te bevestigen of we een model van TRALI hebben ontwikkeld. Twee tot vier dagen en drie maanden na de studiedag wordt een venapunctie van 4 ml verricht om bloedplaatjes kinetiek te onderzoeken en te bepalen of er antistoffen tegen biotine zijn ontstaan. Tevens wordt in de groep LPS + natriumchloride oplossing extra metingen verricht. In deze groep vrijwilligers vindt gedurende de studiedag EEG-dopler metingen plaats om de neurovasculaire koppeling te onderzoeken tijdens vroege endotoxemie. Daarnaast zal de cardiac output bepaald worden met behulp van de nexfin (kleine cuff om de vinger).

De bloeddonatie:
1. Het doneren van een bloedtransfusie zal gebeuren zoals dit ook normaal op de
bloedbank Sanquin plaats vindt. De bloedafname kan gepaard gaan met wat pijn en
de kans op een blauwe plek. De bloedtransfusies worden door Sanquin verwerkt
volgens hun standaardprotocol tot klinische bloedproducten.

De bloedproducten:
1. De bloedtransfusies zijn van de proefpersoon zelf afkomstig en zullen
daarbij geen risico vormen voor bijvoorbeeld virus transmissie. De mogelijkheid
bestaat dat de transfusie milde longschade induceert van voorbijgaande aard. De
proefpersoon zal dit misschien ervaren als milde benauwdheid.
2. Het bloedproduct zal voor transfusie gelabeld worden met biotine (vitamine
B8) waarmee de cellen na transfusie geïdentificeerd kunnen worden middels flow
cytometrie (FACS). Labeling vindt plaats onder steriele condities volgens reeds
bestaande protocollen. Voor transfusie worden kweken afgenomen om de
steriliteit te bevestigen waarmee er geen risico is op infectie bij de
ontvanger. In eerdere studies ontwikkelden 1 op de 8 vrijwilligers antistoffen
tegen biotine. Deze waren na een jaar weer verdwenen en hadden geen klinische
relevantie. Herhaalde infusie van biotine gelabelde bloedplaatjes hadden geen
nadelige gevolgen.
3. Gedurende opslag van het bloedproduct verkregen uit de bloeddonatie van de
proefpersoon zal er een paar keer een monster uit het bloedproduct worden
gehaald om de veranderingen gedurende opslag te kunnen meten. Deze afnamen
vinden onder steriele omstandigheden plaats waarbij risico op bacteriële
contaminatie nihil is.

Het onderzoek:
1. Het twee maal ondergaan van een röntgenfoto betreft een zeer lage
stralingsbelasting.
2. Voor het onderzoek zal een infuus worden ingebracht in de slagader in de
pols of in de slagader in de elleboogsplooi van de arm (arterielijn). Deze plek
wordt eerst verdoofd. Met deze techniek is inmiddels door de onderzoekers veel
ervaring opgedaan. Er bestaat bij deze techniek een kleine kans op blauwe
plekken of bloedstolsel vorming in het bloedvat. Gedurende de laatste jaren
hebben zich in onze handen op het operatie complex (15-20 patiënten per dag)
geen complicaties bij deze procedure voorgedaan. Het plaatsen van een
arterielijn wordt uitgevoerd door een ervaren anesthesist.
3. Toediening van endotoxine kan leiden tot milde griepachtige symptomen, die
kunnen bestaan uit een geringe stijging van lichaamstemperatuur, spierpijn
en/of moeheid.
4. De bronchuslavage (longspoeling) wordt uitgevoerd door een ervaren longarts.
Het belangrijkste ongemak is een droge hoest ter plaatse van het neusgat danwel
mond waardoor de scoop geïntroduceerd wordt. Deze klachten worden echter
onderdrukt door de eerder genoemde lidocaine spray. Daarnaast kan er eventueel
binnen 24 uur koorts ontstaan.
5. De bloedafnames tijdens het onderzoek worden uit de arterielijn gedaan en
zullen dus niet gepaard gaan met extra prikken. De hoeveelheid bloed die
tijdens de studie dag afgenomen wordt is 150 ml. De 150 ml bloedafname is naast
de bloeddonatie van 150 - 400 ml waarvan de proefpersoon afhankelijk van de arm
die hij/zij loot het merendeel (de bloedplaatjes) op de studiedag terug krijgt.
Deze wisselingen in bloedvolume kan het lichaam in korte tijd weer volledig
aanvullen. Het is niet toegestaan om in de drie maanden voorafgaand aan deze
studie of tijdens deze studie bloeddonaties te geven of mee te doen met een
andere studie.
6. De transfusie van de gelabelde bloedplaatjes heeft geen bijwerkingen. Bij 1
op de 8 vrijwilligers ontstaan er antistoffen in het bloed tegen biotine. Deze
verdwijnen binnen een jaar vanzelf weer en hebben geen gevolgen voor de
gezondheid. Wel mag de vrijwilliger gedurende deze periode niet opnieuw een
infuus-behandeling met biotine ondergaan.
7. Het gebruik van Indocyaninegroen wordt toegediend via het infuus. Dit infuus
hebben de vrijwilligers ook nodig voor de toediening van de LPS en het
bloedproduct. Daarom is onze inschatting dat het gebruik van indocyaninegroen
weinig bezwarend is voor de vrijwilligers.

Risico:
De bijwerkingen kunnen als mild ingeschat worden vanwege de volgende redenen:
1. Studies binnen ons onderzoeksinstituut hebben laten zien dat het toedienen
van E. coli LPS met een dosis van 4 ng/kg in gezonde vrijwilligers veilig is.
Wij zullen echter een lagere dosis van 2 ng/kg toedienen waarbij er nog wel
priming van de neutrofielen ontstaat maar geen SIRS reactie.
2. Het toedienen van verse dan wel opgeslagen autologe transfusie producten in
gezonde vrijwilligers blijkt ook veilig te zijn. De combinatie van deze twee
modellen kunnen mogelijk tijdelijke bijwerkingen veroorzaken.

De bijwerkingen beschouwen we als mild zoals in sectie E9 beschreven. De
redenen hiervoor zijn als volgt;
1. Dierstudies die de combinatie van deze twee modellen gebruiken laten slechts
milde longschade zien.
2. In het model wat wij voorstellen gebruiken we een 1000 maal lagere dosis van
LPS (2ng/kg) in vergelijking met de dierstudies. Dit zal het model nog milder
maken en de kans op bijwerkingen doen verminderen.
3. Een vergelijkbaar model met LPS als "first hit" en opgeslagen rode
bloedcellen als "second hit"' dat in ons instituut is ontwikkeld, blijkt veilig
toepasbaar bij gezonde vrijwilligers.
4. In eerdere studies in gezonde mensen met biotine gelabelde rode bloed cellen
ontwikkelden 1 op de 8 vrijwilligers antistoffen tegen biotine. Deze waren na
een jaar weer verdwenen en hadden geen klinische relevantie. In een
bloedplaatjestransfusiemodel is de ontwikkeling van antistoffen niet bepaald
maar in dit onderzoek gaf herhaalde intraveneuze blootstelling aan biotine
gelabelde bloedplaatjes geen nadelige effecten bij gezonde vrijwilligers. Het
biotinyleren is hiermee veilig gebleken.
5. Indocyanine groen is veelvuldig getest in zowel gezonde vrijwilligers als in
ernstig zieke patiënten. Hierbij zijn geen nadelige effecten aangetoond. Omdat
dit product jodium bevat worden vrijwilligers met schildklierproblemen, een
allergie of overgevoeligheid voor jodium(producten) uitgesloten van deelname.
6: continue EEG-dopler metingen en nexfin zijn non-invasieve metingen, deze
zijn pijnloos.