Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOECs) en Megakaryocyten (MKs) voor in vitro studies van hemostatische en secretoire functie.

Achtergrond:
Von Willebrand factor (VWF), een lang multimeer adhesief plasma eiwit, vervult
een cruciale rol in de bloedstelping door de adhesie van bloedplaatjes aan de
(beschadigde) vaatwand te mediëren en door als chaperone de
bloedstollingsfactor VIII (FVIII) in de circulatie te beschermen tegen
premature klaring. Het overgrote deel van het VWF in plasma wordt
gesynthetiseerd door endotheelcellen, die het tijdelijk opslaan in zogenaamde
Weibel-Palade bodies (WPBs) voordat ze het in het bloed secreteren.
Bloedplaatjes slaan VWF ook op in alpha-granules van waaruit ze het secreteren
na activatie, wat bijdraagt aan de vorming van een thrombus. De moleculaire
mechanismen waarmee secretie van VWF uit endotheelcellen en bloedplaatjes wordt
gecontroleerd zijn voor een groot deel nog onbegrepen. Afwijkingen in de
secretie functie van bloedplaatjes enn endotheelcellen kunnen leiden tot
bloedingsproblemen, zoals bijvoorbeeld bij bloedplaatjes Storage Pool Disease
(SPD), Von Willebrand Disease (VWD) en in individuen met "laag VWF".

Probleem definitie:
In ~30% van de patiënten met type 1 VWD (gedefinieerd als VWF <50 IU/dL) zijn
geen mutaties in VWF aanwezig en wordt het ziektebeeld door mutaties in
genetische loci buiten VWF veroorzaakt. Daarnaast is het in ~50% van de
patiënten met bloedingsproblemen die naar tertiaire centra worden verwezen niet
mogelijk om een moleculaire diagnose van hun klinische bloedingsafwijking te
stellen, de zogenaamde Bleeding of Unknown Cause (BUC). Desmopressin wordt
therapeutisch toegediend bij patiënten met bloedingsproblemen om bloedplaatjes
functie te versterken. Desmopressin verhoogt VWF spiegels in plasma via
geïnduceerde secretie van VWF uit in endotheelcellen opgeslagen Weibel-Palade
bodies (WPBs). Doot tot nu toe onbegrepen oorzaak leidt desmopressin in ca 25%
van de patiënten niet tot een vehoging van VWF/FVIII spiegels.

Onderzoeksvraagstelling
De hypothese van deze studie is dat defecten in componenten van de secretie
machinerie van VWF causaal betrokken zijn bij gereduceerde VWF waardes in
plasma van patiënten met bloedingsproblemen, bij een gereduceerde desmopressin
response en bij bloedingsproblemen bij patiënten met Bleeding of Unknown Cause
(BUC). Ten einde nieuwe determinanten van circulerende VWF spiegels en
bloedingsfenotype te vinden gaan we de secretie mechanismen in endotheelcellen
en bloedplaatjes bestuderen bij patiënten met afwijkingen in hemostatische
en/of secretoire functies. Hiervoor zullen we patiënt-gebaseerde ex vivo
cellulaire model systemen van endotheel en bloedplaatjes secretie genereren met
behulp van blood ougrowth endothelial cells (BOECs), bloedplaatjes,
CD34+-gederiveerde megakaryocyten en induced pluripotent stem cell
(iPSC)-gederiveerde endotheelcellen (iPSC-ECs) en megakaryocyten (iPSC-MKs).

1. Om geoptimaliseerde technieken op te zetten voor de isolatie en
karakterisatie van BOECs, CD34+-gederiveerde MKs, iPSC-ECs en iPSC-MKs.
2. Met behulp van BOECs, bloedplaatjes, CD34+-gederiveerde MKs, iPSC- ECs en
iPSC-MK de cellulaire mechanismen die de secretie functie van endotheelcellen
en bloedplaatjes controleren uitpluizen, teneinde de pathofysiologie van
bloedstollingsziekten en de genetische controle van VWF secretie beter te
begrijpen.
3. Om in vitro methodes te ontwikkelen om in BOECs of iPSC-MKs met behulp van
CRISPR genome editing (ziekte-verwekkende) mutaties in regulatoren van
endotheel of bloedplaatjes functie te introduceren of te corrigeren,

Deze studie is een basaal wetenschappelijke, experimentele in vitro studie
waarvoor afname van bloed bij studie deelnemers noodzakelijk is.

De studiedoelen kunnen alleen worden gehaald door cellen van patiënten en
individuen met hemostatische en/of secretoire afwijkingen te bestuderen.
Deelnemers aan deze studie zullen niet direct voordeel halen uit deze studie,
echter, het ongemak is minimaal en beperkt zich tot een venepunctie, wat een
minimaal risico met zich meebrengt. Deelnemers kunnen, als dit noodzakelijk is,
nogmaals worden opgeroepen om bloed af te staan; dit zal beperkt worden tot
maximaal 3 bloedafnames.